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蛋氨酸是合成生物蛋白质的20种基础氨基酸之一,在动物和病原菌的多种生理过程中发挥着重要的作用,如甲基化反应、清除机体活性物质和多胺合成等。病原菌在黏附定植宿主后,宿主和共生微生物能限制病原菌对蛋氨酸的获取,以此影响病原菌的正常生长和定植。然而大部分的病原菌能够克服宿主对自身的蛋氨酸限制,因为病原菌自身能够合成蛋氨酸而不依赖宿主环境,因此阻断病原菌的生物合成途径是一种新型的抗菌策略,可用于抗生素替代药物的开发。本研究以啮齿类柠檬酸杆菌（Citrobacter rodentium,C.rodentium）为研究对象,探究了蛋氨酸合成酶MetA缺失对细菌生理功能及感染进程的影响,并使用MetA抑制剂α-甲基蛋氨酸（α-Methyl-methionine,α-MM）验证蛋氨酸合成途径作为抗菌靶点的可行性。具体的研究和结果如下:1.metA缺失对C.rodentium生理功能的影响metA是负责编码C.rodentium蛋氨酸生物合成过程中O-高丝氨酸乙酰转移酶的基因,为了探究阻断细菌蛋氨酸生物合成对C.rodentium功能的影响,本研究利用自杀性质粒pRE112构建出了C.rodentium的metA缺失株ΔmetA和回补株Comp-ΔmetA/pBR322metA,并检测了生长曲线、对Caco-2细胞的黏附性、Ⅲ型分泌系统相关毒力基因的表达、造成A/E损伤的能力以及感染Caco-2细胞后细胞炎性因子的表达。研究结果发现,在低浓度蛋氨酸环境下ΔmetA在M9基本培养基的生长受到抑制,而额外添加高浓度的蛋氨酸后ΔmetA的生长得到恢复。在30 μM蛋氨酸的环境下,与WT相比,ΔmetA对Caco-2细胞的黏附能力、诱导A/E损伤的能力、Ⅲ型分泌系统相关基因escC、escV、tir、espA和espB的表达都显著降低（p＜0.05）,并且ΔmetA感染Caco-2细胞后细胞的炎性因子Cxcl-1、Il-1β和Il-22表达显著低于WT感染组（p＜0.05）,但是在200μM蛋氨酸的环境下WT和ΔmetA的相关功能没有显著性差异。由此,在低浓度蛋氨酸的环境下,阻断蛋氨酸合成途径能抑制C.rodentium的正常生长、黏附能力和毒力基因的表达,从而降低细菌感染后炎症反应的产生。2.metA缺失对C.rodentium转录组的影响由于蛋氨酸在细菌的多种生理进程中都发挥着重要作用,为了进一步探究metA缺失影响细菌生理功能的机制,本研究使用RNA-seq技术比较了 WT和ΔmetA的转录组,并对两者之间的差异表达基因进行了筛选比较。测序的结果显示,metA缺失后共产生了 3565个差异表达基因,其中有1795个上调基因,1770个下调基因。差异基因富集结果表明,metA缺失后主要影响了 C.rodentium蛋白质合成相关的生物过程,包括细胞大分子生物合成过程、细胞氮化合物生物合成过程、蛋白代谢过程、大分子合成过程和细胞蛋白质代谢过程等。进一步的分析发现,metA缺失能通过改变蛋氨酸及其上游的氨基酸代谢、蛋白质翻译相关的氨酰tRNA合成酶的活性以及对多种蛋白质修饰酶的活性来影响蛋白质的合成过程。另外,分析还发现metA缺失能通过改变蛋氨酸、半胱氨酸和谷胱甘肽的代谢,影响C.rodentium的抗氧化能力;以及通过改变甲基转移酶的活性影响细菌的甲基化进程。这些分析结果说明metA缺失能作用于细菌蛋白质的合成、抗氧化能力和甲基化进程来影响C.rodentium的生理功能。3.metA缺失对C.rodentium感染进程的影响为了更进一步从体内验证细菌的蛋氨酸合成途径能否成为抗菌靶点,本章探究了 metA缺失对C.rodentium感染后致病能力的影响。本研究使用WT、ΔmetA和Comp-ΔmetA分别感染C57BL/6小鼠后,对小鼠体重变化、肠道和粪便载菌量、结肠炎性因子表达、结肠毒力基因表达以及结肠病理变化进行检测。研究结果显示,感染后ΔmetA组小鼠的体重显著高于WT组和Comp-ΔmetA组（p＜0.05）;而ΔmetA组小鼠的肠道和粪便载菌量则显著低于WT组和Comp-ΔmetA组（p＜0.05）,证明metA基因缺失能缓解C.rodentium感染诱导的小鼠体重降低,并降低C.rodentium在肠道的定植。另外,ΔmetA组小鼠结肠中毒力基因escV、espA和espB的表达和结肠炎性因子Il-1β、Il-22和Tnf-α的表达也显著低于WT组（P＜0.05）,同时ΔmetA组小鼠的结肠隐窝增生症状也有明显的缓解。上述结果证明了 metA基因的缺失能通过阻断C.rodentium在小鼠肠道环境中对蛋氨酸的合成,从而抑制C.rodentium在小鼠肠道内的定植和毒力基因的表达,降低对宿主炎症反应的诱导,保护小鼠肠道的完整性。4.α-甲基蛋氨酸对C.rodentium生理功能的影响α-甲基蛋氨酸（α-Methyl-methionine,α-MM）是一种蛋氨酸类似物,能够抑制MetA蛋白的催化活性。为了验证α-MM作为MetA抑制剂的抗菌作用,本章探究了 α-MM对C.rodentium功能的影响。研究结果显示,在低浓度蛋氨酸环境下α-MM能抑制细菌的生长,并且抑制的效果与α-MM浓度呈正比,但在高浓度蛋氨酸环境下对细菌生长没有影响。在30 μM蛋氨酸的条件下,α-MM处理显著降低了 metA基因的表达（p＜0.05）,并且抑制了 C.rodentium对Caco-2细胞的黏附能力、诱导A/E损伤的能力、Ⅲ型分泌系统毒力基因escC、escV、tir、eae和espB的表达（p＜0.05）,并显著降低感染后Caco-2细胞的炎性因子Cxcl-1、Il-1β和Tnf-α的表达（p＜0.05）,而在100 μM蛋氨酸环境α-MM对C.rodentium的功能没有显著性影响。以上结果证明α-MM在低浓度蛋氨酸的环境下能通过抑制细菌metA基因的表达,阻断其蛋氨酸生物合成,从而影响细菌的相关功能。5.α-甲基蛋氨酸对C.rodentium感染进程的影响为了进一步在体内验证α-MM对C.radentium感染进程的影响,本研究使用了不同浓度的α-MM对小鼠进行一周的预处理,之后用C.rocdentium对小鼠进行感染,检测了感染后小鼠体重、肠道和粪便载菌量、结肠炎性因子表达、结肠metA和毒力基因表达以及结肠病理切片等相关指标。结果显示,50 mg/kgα-MM处理组小鼠的体重显著高于C.rodentium感染对照组（p＜0.05）,而肠道和粪便的载菌量要显著低于C.rodentium感染对照组（p＜0.05）,说明50 mg/kgα-MM处理能缓解C.rodentium感染诱导的小鼠体重降低并抑制C.rodentium在小鼠肠道的定植。而100、150和200 mg/kg α-MM处理组小鼠的体重和肠道及粪便载菌量没有显著性差异,说明50 mg/kg是α-MM对小鼠的最适处理浓度,因此以该组作为α-MM处理组进行后续试验的分析。后续的结果发现,α-MM处理组小鼠结肠的metA基因和毒力基因espA、espB、escC和escV以及结肠的炎性因子Il-1β、Tnf-α、Cxcl-1和Il-22表达均要显著低于感染对照组（p＜0.05）,同时α-MM处理也能缓解感染诱导的结肠损伤。结果证明α-MM在体内能通过抑制C.rodentium的蛋氨酸合成,影响细菌的感染进程,提示α-MM可以作为病原菌蛋氨酸合成为靶点的候选抗菌药物。