轮状病毒(Bovine Rotavirus, BRV)属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)轮状病毒属(Rotavirus),是引起各种幼龄动物病毒性腹泻的主要病原之一。该病自报道以来,已在全世界主要养牛国家普遍发生和流行,给养牛业造成严重的经济损失。常用检测方法有RT-PCR,ELISA等,可由于需要昂贵的设备和专业人员而不便于在临床普遍应用,所以急需一种方便简单的检测方法。环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)通过具有链置换特性的Bst DNA聚合酶完成靶序列的扩增,仅需恒温就能扩增核酸,并可通过核酸染料染色或者离心沉淀观察结果,较之普通的RT-PCR方法,具有简便、快速的特点。对保定地区发病牛场的犊牛腹泻病料进行处理,得到疑似病毒液,然后将其接种到Marc-145细胞上,37℃CO2条件下盲传四代后,细胞出现皱缩、变圆、界限不清晰、崩解等病变。根据GenBank发表的牛轮状病毒VP7基因序列,设计了一对特异性引物。用此引物对出现细胞病变的培养液进行RT-PCR检测,所得目的片段与预期片段长度(342bp)一致。将RT-PCR产物纯化回收,进行克隆转化及序列测定,分析结果与预期的结果相同。对该毒株的理化特性鉴定结果表明:该株牛轮状病毒不耐热,对氯仿、强酸、乙醚有良好的抵抗力。证实本研究分离出的病毒为牛轮状病毒,命名为BD株。本研究将建立检测BRV的RT-LAMP检测方法。根据GenBank中发表的BRV基因序列,用DNAstar进行分析和比对后发现,VP7的基因序列相对保守,故针对VP7进行引物设计。利用Primer Explorer4.0引物设计软件,严格按照引物设计原则及注意事项进行引物设计,并对设计出的引物进行筛选,最终确定一组,包括外引物F3、B3,内引物FIP、BIP。用此引物对提取好的病毒RNA进行RT-LAMP反应,并对试验反应条件进行优化。结果表明,RT-LAMP最佳反应温度是62℃,反应时间为50min;优化的各组分浓度分别为:Mg2+ 2.5μL,dNTPs 3.5μL,Bst DNA聚合酶1.5μL;外引物和内引物最佳浓度比为1:6,即外引物(F3:B3=1:1)共计为1μL,内引物(FIP:BIP=1:1)共计为6μL。对经过摸索条件后建立的反应体系进行灵敏度、特异性、重复性和稳定性试验,结果表明,RT-LAMP的敏感性是RT-PCR的100倍;特异性试验结果显示无交叉反应存在,说明该检测技术特异性较好;批间和批内的检测结果无明显差异,说明该检测方法相对稳定,重复性较好。用本试验建立的RT-PCR和RT-LAMP方法对49份样品提取的RNA进行检测后,结果表明两种方法的符合率达到100%。本研究成功建立了BRV的RT-LAMP检测技术。