近半个世纪以来,在中国乃至世界范围内,肺癌的发病率及死亡率一直在不断攀升。肺癌最常见的几个组织类型包括非小细胞肺癌和小细胞肺癌,前者又可分为大细胞癌,鳞状细胞癌以及腺癌。近年来,由于低焦油含量型烟草产品的出现,肺腺癌的发病率已经超过鳞状细胞癌,成为肺癌的主要类型。而女性对肺腺癌的易感性较前也有所增加。早期诊断是有效降低肺腺癌死亡率的重要手段。因肺腺癌早期常无明显容易发现的特征性临床症状,故早期确诊困难很大。肿瘤早期发生淋巴结及远处器官转移是影响肺腺癌总体预后的重要原因之一。大部分肺腺癌患者在得到确诊时已处于疾病的晚期阶段,甚至已经伴有区域淋巴结转移和远处转移。虽然随着分子生物学技术和临床诊治水平的高速度发展,我们对肺腺癌的分子生物学机制的认识有了一些进步,但我们对于其发病详细机制仍然认识不足,目前缺乏行之有效的可以早期确诊肺腺癌以及判断其预后的方法。故需要进行更多的研究,来阐明相关的发病分子机制,以期找到更合适的早期诊断、治疗以及预防肺腺癌转移的有效方法,来延长患者的生存期限,提高患者生活质量。恶性肿瘤的生物学特性就是无限制的生长。这种不受任何限制的增生一方面会夺取掉大量正常组织生长需要的营养物质,从而导致机体感觉体乏无力,出现身体逐渐消瘦甚至出现恶病质的现象；另一方面肿瘤细胞的增生还会产生大量的毒素,可以引起机体产生各种不适症状,例如持续低热等。恶性肿瘤可以通过直接转移、血液途径转移以及淋巴管路途径等转移到周围临近组织器官或者远处器官形成新的转移灶,故恶性肿瘤的预后较差。因为新生血管可为肿瘤组织提供生长所必须的充足的氧气和营养物质,肿瘤细胞的增殖、对周围临近组织的浸润以及远处转移均是以血管生成为基础的。HIF-1α为特异性低氧状态下具有活性的转录因子,其表达较为广泛,在多种恶性肿瘤中都参与肿瘤血管的新生活动。细胞外基质具有阻止细胞自由移动的的作用,如果被降解则失去阻止细胞移动的功能,从而有利于肿瘤细胞发生转移。基质金属蛋白酶可以降解掉细胞外基质的多种胶原。正常情况下,细胞外基质的胶原可以防止肿瘤细胞入侵,无论是阻止肿瘤细胞侵袭还是防止肿瘤细胞发生远处转移,细胞外基质均发挥重要作用。一旦细胞外基质被酶水解,其防御功能减弱,更有利于肿瘤的侵袭和转移。金属蛋白酶-9是基质金属蛋白酶的一种,在肿瘤生长和侵袭过程中发挥重要作用。已有文献报道,金属蛋白酶-9表达的水平与非小细胞肺癌的预后有相关性。临床上大家较认可的肿瘤新生血管评价方法是免疫组化染色后测定肿瘤组织的微血管密度,从而可以评价肿瘤新生血管的有关信息。准确度高,但是因其为有创性操作,患者常不愿接受该检查。而且因为有创,该检查对于持续评价肿瘤血管治疗后的情况变化可操作性欠佳。因此,随着影像学检查技术的迅速发展,CT、MRI、超声等在肿瘤血管评价方面都做了相应的尝试。既往认为,因受肺内气体的强反射和肩胛骨及肋骨的干扰,超声在肺部的应用受到很大限制。但近年来,随着超声仪器的更新换代以及技术的不断进步,超声在胸壁、肺周边部病变,肺水肿等疾病中的应用逐渐增多。超声对于肺癌,主要是邻近胸壁的周围型肺癌、肺上沟肺癌,邻近膈肌的肺底部癌及合并阻塞性肺炎或肺不张的某些深部肺癌的诊断有其独特的价值。超声多普勒具有无创、可重复性强、可实时监测组织血流变化等特点,故可以结合CDFI检测肿瘤组织血供情况,从而为评价肿瘤组织血管新生程度提供新的无创检测方法。本研究第一部分旨在通过检测肺肿瘤组织中MMP9、HIF-la的表达情况,结合超声显示肿块血供情况,讨论超声血流分级情况在评价周围性肺腺癌血管生成程度中的应用,为周围型肺腺癌的无创诊断以及对肺癌治疗效果的预判提供理论依据。综合目前医学研究的各种学说,目前学术界大多认为恶性肿瘤的发生是多种因素长期相互作用相互影响的结果。笼统的说,导致恶性肿瘤发生的多种因素包括内因和外因。基因遗传和基因突变等遗传因素、内分泌因素以及免疫因素均属于机体内在因素,化学因素、物理因素、生物因素等均属于外在环境因素。现在随着我国经济建设的日新月异,大多数化学污染物及重金属等污染物会随着农药的应用、化工废料的排放、金属冶炼后废旧残渣的倾倒等各种工业活动进入我们的生活环境中,环境污染已经成为引起恶性肿瘤发生的重要因素。已经有多个报道,我国某些地市因生活环境被某些化学产品或者某种重金属污染,从而造成该地区生活群众恶性肿瘤集中发生的现象,甚至出现了“癌症村”。环境污染作为恶性肿瘤的诱因已不容忽视。有研究发现,在肿瘤发生过程中,重金属污染物起到较重要的作用。一方面,重金属污染物被吸收入机体后可以诱导其基因发生突变,从而有进一步发生恶性肿瘤的可能,另一方面,已经发生基因突变的机体,对于其所处周围环境中的重金属污染物的刺激更加敏感。当两者同时存在于同一机体时,该机体发生肿瘤的可能性会大大增加。有统计资料显示,约3/4的肿瘤是由于重金属污染引起的。例如,已明确发现,砷可以引起包括肺癌、皮肤癌在内的多种恶性肿瘤的发生。目前人类生活环境中镉污染主要来源于现代工业生产。重金属镉目前已被大量应用到油漆、电镀等行业中。镉对人体健康的危害非常之严重。重金属镉已经被美国毒物管理委员会列为严重危害人体健康的毒物之一。早在1993年时,镉即被国际肿瘤研究机构划分为致癌物质。镉在机体内的生物半衰期很长,可达10～30年,所以,镉在机体内很容易被蓄积。饮食、吸烟以及相关职业暴露是人类长期慢性接触微量镉污染的主要来源。长期低剂量接触镉对人体可能还有很多严重的目前尚未知的危害。虽然镉暴露与一些器官发生肿瘤的关系尚不清楚,但是已经证实,镉在人体内可引起肺癌的发生。在细胞实验以及啮齿类动物实验中已经有许多关于镉引起肿瘤的机制研究,且有些实验发现,在啮齿类动物中,镉与肺腺癌的发生有剂量依赖关系。但镉是如何促进肺腺癌发生及发展的,其具体机制尚不明确。血管新生指的是在已存在的血管上生成新的血管的过程。机体内密布的血管网络为机体组织提供可以交换的氧气和所需的营养物质,同时排出代谢产物。对肿瘤的增殖及转移等实体肿瘤的生长过程同样有着非常重要的作用。据报道,在含氧量偏低的环境中,肿瘤细胞可以在其局部分泌血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(bFGF)等多种促进血管生成因子。血管内皮细胞上分布有多种生长因子受体的表达,例如VEGF受体2,FGF受体1等。这些受体与其相应生长因子结合后,一系列调节因子被激活而发挥作用,使得血管内皮细胞增生能力及迁移能力增强。据研究证实,镉对血管内皮有毒性作用。但迄今为止,镉对于肿瘤血管生长的作用仍存有争议。有研究表明,在一定的浓度范围内,镉可以增加VEGFR2活性并促进内皮组织血管形成。然而,也有研究表明,镉可以损伤人乳腺癌细胞诱导血管新生的能力。故镉对肺腺癌中血管生成是否有影响目前尚未明确。为阐明镉在肺腺癌血管新生中的作用及其机制,我们观察镉对人肺腺癌细胞中血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(b-FGF)表达及分泌的影响,观察镉处理的A549肿瘤条件培养液与HUVECs共培养时对HUVECs增殖、迁移及凋亡的影响；观察镉直接作用于A549细胞的增殖、迁移及凋亡的影响,以期发现镉在肺腺癌血管新生、恶性肿瘤生成、侵袭及转移中的作用及作用机制。第一部分：超声检测肺腺癌血流分级与血管生成的相关性研究研究目的：应用多普勒超声评价周围性肺腺癌的血供情况,通过检测肿瘤组织血管分布密度特点,反应肿瘤血供程度。同时检测肺腺癌组织中缺氧诱导因子-1a(HIF-1α)、MMP9在肿瘤组织中表达水平,比较周围型肺腺癌血管生成因子与其相应多普勒超声评价血流分级之间的关系。研究方法：对66例经术后病理诊断为肺腺癌的周围性肺癌病人术前进行常规二维超声和CDFI检查,根据CDFI所示血供丰富程度共分为O～Ⅲ4个等级,其中O-Ⅰ级为乏血供组,Ⅱ～Ⅲ级为富血供组。将患者手术切除的肿瘤组织,运用免疫组化方法检测HIF-1α、MMP9在肺癌组织中的表达情况。结果：66例肺腺癌患者,CDFI示血流分级为0级肺腺癌患者16例,其中6例HIF-1α表达阳性,阳性率为37.5%,5例MMP9表达阳性,阳性率为31.2%。CDFI示血流分级为Ⅰ级肺腺癌患者共11例,其中6例HIF-1α表达阳性,阳性率为54.5%,5例MMP9表达阳性,阳性率为45.4%。CDFI示血流分级为Ⅱ级肺腺癌患者共23例,其中16例HIF-1α表达阳性,阳性率为69.5%,15例MMP9表达阳性,阳性率为65.2%。CDFI示血流分级为Ⅲ级肺腺癌患者共16例,其中12例HIF-1α表达阳性,阳性率为75%,13例MMP9表达阳性,阳性率为81.2%。肺腺癌病灶内超声血流分级与HIF-1α及MMP9的表达呈正相关(P<0.05)。结论：超声探及周围性肺腺癌的血供分级水平能反应相应病灶内血管新生程度,对临床选择肺癌的诊治方案有一定意义。第二部分：低浓度镉致肺腺癌血管新生机制的研究研究目的：通过检测一系列低浓度镉对肺腺癌A549细胞VEGF和b-FGF表达和分泌的影响,进一步收集镉处理的A549肺腺癌细胞条件培养液,观察条件培养液对HUVECs细胞的影响。探讨在体外实验中,镉对肺腺癌肿瘤细胞血管新生的影响及其可能的作用机制。研究内容、方法：1.Cd对人肺腺癌A549细胞VEGF及b-FGF的影响。使用不同浓度的CdCl2 (0.1μM,0.5μM, 1μM,5μM, and 10μM)处理人肺腺癌A549细胞,观察A549细胞生长情况,用实时荧光定量PCR法检测不同浓度镉处理后A549细胞中VEGF及b-FGF mRNA的表达水平。用免疫印迹法(Western blotting)检测镉处理后A549细胞VEGF蛋白表达的变化,ELISA法检测镉处理后A549细胞VEGF及b-FGF的分泌。分析镉对肺腺癌A549细胞VEGF及b-FGF的影响。2.Cd处理的A549细胞条件培养液对HUVECs细胞增殖和迁移的影响。制作A549细胞条件培养液。使用A549细胞条件培养液处理HUVECs细胞,采用MTT法检测Cd处理的A549条件培养液对HUVEC细胞增殖的影响。用ECIS法检测HUVECs细胞损伤后修复(迁移)情况。使用流式细胞仪检测HUVECs细胞的凋亡率。3.Cd对人肺腺癌A549细胞HIF-1α蛋白表达的影响。使用1μM CdCl2处理A549人肺腺癌细胞株,使用免疫印迹法(Western blotting)检测A549细胞HIF-la蛋白的表达。4.Cd对人肺腺癌A549细胞增殖、迁移及凋亡的影响。使用不同浓度的CdCl2 (0.1μM,0.5μM, 1μM,5μM, and 10μM)处理人肺腺癌细胞A549,用MTT检测镉对A549细胞增殖、迁移及凋亡的影响。结果：1.低浓度Cd(0.5μM,1μM)可以促进人肺腺癌A549细胞VEGF mRNA的表达,Cd对人肺腺癌A549细胞b-FGF mRNA的表达无明显影响。人肺腺癌A549细胞经0.5μM、1μM Cd处理后,VEGF mRNA水平明显增加,有统计学意义(0.5μM:1.52±0.17,P<0.05:1μM:2.5±0.39,P< 0.01).人肺腺癌A549细胞经0.1μM、5μM、10μM Cd处理后,VEGF mRNA水平无明显变化(0.1μM:1.07±0.04,P=O005:5μM:1.53±0.51,P=0.154; 10μM:1.11±0.23,P=0.468).人肺腺癌A549细胞经不同浓度Cd处理后,b-FGF mRNA水平均无明显变化。2.低浓度Cd(1μM)促进人肺腺癌A549细胞VEGF蛋白的合成和分泌,对b-FGF蛋白分泌无明显影响。人肺腺癌A549细胞经1μM Cd处理后,细胞内VEGF蛋白水平明显增加(Control:1.11±0.13:Cd:1.79±0.17,P<0.05),培养基中VEGF水平明显增加(1.58±0.11,P<0.01),b-FGF无明显变化(1.05±0.14,P=0.74)。3.镉处理后的肺腺癌A549细胞条件培养液可促进HUVECs细胞增殖和迁移。与对照组相比,经Cd-A549条件培养液后,MTT显示HUVECs细胞增殖明显增加(1.25±0.06,P<0.01),ECIS示跨细胞电阻明显增加(1.64±0.19,P<0.05),也证明HUVECs细胞的迁移明显增加。流式细胞仪检测结果示细胞凋亡无明显变化。4.低浓度Cd促进人肺腺癌A549细胞HIF-1p的蛋白合成。人肺腺癌A549细胞经1μMM Cd处理后,细胞内HIF-1α蛋白水平明显增加,有统计学意义。5.Cd对人肺癌腺癌细胞A549细胞的增殖能力、迁移能力及凋亡均无明显影响。人肺腺癌A549细胞经一系列浓度Cd(0.1μMM,0.5μM,1μM,5μM,and 10μM)处理后,MTT检测发现A549细胞增殖能力无明显变化,划痕实验检测发现A549细胞迁移能力无明显变化,流式细胞仪检测结果显示A549细胞凋亡无明显变化。结论：1.低浓度镉刺激人肺腺癌A549细胞,使A549细胞VEGF表达和分泌增加,从而促进血管内皮细胞的增殖和迁移,发挥其促进肿瘤血管新生的作用。2.低浓度镉可能通过增加HIF-1α的合成促进VEGF的分泌。3.低浓度镉对肺腺癌细胞本身的生长和增殖没有明显的作用。