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干扰素γ(interferon-gama,IFN-γ)是一类由特定免疫细胞分泌的多功能蛋白质。IFN-γ属于Ⅱ型干扰素,温度稳定性及耐酸性较差,易失活。但IFN-γ具有抑制肿瘤细胞生长、抗病毒、抗寄生虫感染、调节机体特异性免疫等功能,目前已将重组IFN-γ生物制剂应用于人乙型、丙型肝炎的治疗过程并取得了良好的治疗效果。因此,IFN-γ在治疗病毒性疾病、调节机体免疫力方面具有良好的应用前景。鱼类干扰素研究虽起步相对较晚,但成果较为显著,已通过基因工程等方法获得多种鱼的IFN基因及重组蛋白。本研究是利用基因工程方法构建重组工程菌获得具有生物学活性的重组蛋白。从NCBI获得红鳍东方鲀干扰素γ基因ORF序列,利用生物学软件分析其序列特征,获得成熟肽序列。根据密码子偏爱性对红鳍东方鲀IFN-γ成熟肽序列进行优化。优化后的序列与质粒pPICZαA相连,双酶切鉴定。利用限制性内切酶SacⅠ将重组质粒进行线性化,电转化整合到毕赤酵母GS115基因组中。用含有高浓度Zeocin的培养基进行高拷贝菌株的筛选,BMGY/BMMY液体培养基进行扩大培养及诱导表达,SDS-PAGE电泳检测获得分子量约为24 kDa的重组红鳍东方鲀IFN-γ蛋白粗品。细胞病变抑制法检测重组IFN-γ蛋白活性为2018 U/mL。将不同稀释度的重组蛋白液与标准品分别刺激受病毒感染的WISH细胞,测定各浓度下WISH细胞吸光度值并绘制增殖曲线,结果表明,重组红鳍东方鲀IFN-γ蛋白能够抑制病毒感染并促进WISH细胞增殖,与干扰素标准品具有一致的趋势。利用实验室已有的原核表达菌株进行红鳍东方鲀IFN-γ的重组表达,获得浓度为0.346mg/mL的重组IFN-γ蛋白,并对其效价进行检测,结果证明原核表达的重组IFN-γ蛋白活性效价为1.7×105 U/mL,比真核表达的重组IFN-γ蛋白活性高,该结果为后续免疫实验奠定基础。以不同浓度(25μg/mL rIFNg-γ为实验组1、50μg/mL r IFNg-γ为实验组2)的原核表达的重组IFN-γ蛋白免疫6月龄健康红鳍东方鲀,PBS作为对照组,于腹腔注射后6、12、24、36 h取肾脏组织。Trizol法提取组织总RNA,反转录cDNA第一链,实时定量PCR检测IFN-α、IFN-γ、MHCⅠ、Mx1基因特异性及其在肾脏组织内不同时间的表达量差异。结果显示,红鳍东方鲀免疫后6-36 h,IFN-α基因在实验组1中的表达呈现先上升后下降的趋势,24 h时表达量最高;在实验组2中的表达量在6 h最高,随后呈下降趋势。IFN-γ、MHCⅠ在免疫后6 h表达量都出现最大值且实验组1高于实验组2,随后呈下降趋势。Mx1基因的表达则出现上升趋势,24 h时表达量最高,随后下降。利用RNA-Seq分析红鳍东方鲀PBS组和IFN-γ组肾组织转录组,共测得Raw datas分别为29,939,506和24,630,588。原始数据经过滤后分别得到的Clean reads为29,415,565和23,943,395。通过差异基因筛选得到292个差异基因,其中171个在IFN-γ组肾组织中上调表达。GO、KEGG对差异基因进行分类和富集分析。对转录组进行SNP分析,两组分别得到118,876和114,091个SNP位点,其中转换型数量居多。