研究背景胆管癌是起源自胆管上皮细胞的恶性肿瘤。资料表明，在过去数十年中，其发病率呈现上升趋势。目前对于胆管癌的治疗手段非常有限，由于早期胆管癌缺乏典型症状，当出现典型症状的时候，其肿瘤已进入晚期，这时往往不宜手术治疗，而化疗和放疗的作用也非常有限，往往不能起到反应或仅有微弱的反应。因此，寻找一种有效的新型治疗手段对于胆管癌的治疗具有非常重大的意义。CD47是一种广泛表达于多种细胞的表面蛋白，与其受体SIRPα结合后，可以释放负调节信号，具有抑制巨噬细胞等免疫细胞功能的作用，可以保护表达CD47的正常细胞如红细胞等免受免疫系统的杀伤，而当红细胞受损或衰老时，CD47表达量降低，导致其被巨噬细胞吞噬并清除。这是维持机体细胞更新与稳定的一个重要机制。然而，CD47-SIRPα的负调节作用被肿瘤细胞利用，成为其逃避免疫监视的重要机制。多数肿瘤细胞高表达CD47，与巨噬细胞表面的SIRPα结合，抑制巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬，从而成功逃脱免疫细胞的杀伤。同时也有研究表明，CD47-SRIPα可以作为抗肿瘤肿瘤的靶点。其中，封闭性抗CD47单克隆抗体、封闭性SIRPα抗体等研究也取得了一定的进展。但是由于CD47和SIRPα的分布特点，导致其应用受到一定的限制。GM-CSF作为主要的造血因子之一，具有募集并诱导活化DC细胞、巨噬细胞、T细胞等免疫细胞的作用。研究表明，GM-CSF在抗肿瘤免疫反应中具有重要作用。转导了GM-CSF基因的肿瘤疫苗在动物实验和临床实验中均表现出了良好的抗肿瘤效能，而携带GM-CSF基因的溶瘤腺病毒也对膀胱癌具有明确的疗效和良好的安全性。方法与结果在本研究中，我们将具有高亲和力的SIRPα突变株CV1的结合区的基因，与人类IgG1的Fc段基因融合，组成SF融合基因，通过2A与mGM-CSF基因连接，组成SGM基因，插入到35型溶瘤腺病毒SG655的基因组中，构建成为溶瘤腺病毒SG655-SGM，研究其在体外对胆管癌细胞的抗肿瘤作用。主要方法与结果如下：（1）溶瘤腺病毒SG655-SGM及其对照病毒SG655-SF、SG655-GM的构建和鉴定通过分子克隆技术构建了溶瘤腺病毒SG655-SGM和对照病毒SG655-SF、SG655-GM，通过PCR方法对其进行鉴定，结果表明：各个溶瘤腺病毒的目的基因均存在，且没有野生型病毒。（2）目的基因SGM的表达Western Blot结果表明：SG655-SGM和SG655-SF均能正常表达融合蛋白SF；ELISA实验证实：SG655-SGM和SG655-GM均能正常表达mGM-CSF（SG655-SGM和SG655-GM在293细胞中mGM-CSF的表达量分别为311.821.64ng/mL、534.9011.86ng/mL）。（3）溶瘤腺病毒的体外功能验证我们通过流式细胞技术筛选出了CD47高表达的胆管癌细胞EH-CA1-T和EH-CA1-Y。间接免疫荧光实验结果表明：融合蛋白SF能够特异性结合CD47。病毒增殖实验和MTT实验结果表明：溶瘤腺病毒SG655-SGM、SG655-SF、SG655-GM均能在胆管癌细胞中增殖并产生杀伤作用：溶瘤腺病毒SG655-SGM、SG655-SF、SG655-GM均可在胆管癌细胞EH-CA1-Y和EH-CA1-T中有效增殖，其最强增殖时间为48h，增殖倍数约为1000倍；对EH-CA1-T细胞产生半数杀伤的MOI分别为50，20，10；对EH-CA1-T细胞产生半数杀伤的MOI分别为20，10，10。（4）溶瘤腺病毒SG655-SGM及其对照病毒能够显著抑制裸鼠胆管癌移植瘤的生长利用胆管细胞癌EH-CA1-Y构建裸鼠移植瘤模型，用SG655-SGM及其对照病毒瘤内注射治疗，结果显示治疗组肿瘤生长明显受抑制，证实其在体内具有良好的抗肿瘤作用。结论SG655-SGM能够有效感染胆管癌细胞EH-CA1-T和EH-CA1-Y，并能介导外源性治疗基因SF和mGM-CSF的表达；在体外促进巨噬细胞对胆管癌细胞的吞噬作用，抑制肿瘤细胞生长；在体内能够显著抑制肿瘤生长。