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骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)是一类具有多向分化潜能的干细胞,有望成为未来细胞、基因治疗、组织工程技术的理想种子细胞。本研究目的在于分离纯化兔BMSCs,并研究其在体外分化为胰岛细胞的潜能,以便未来利用该类细胞作为疾病细胞和基因治疗的模型。为此,本试验利用一月龄新西兰大白兔为研究对象,较为系统全面地研究了其BMSCs的分离、培养、扩增、鉴定、形态学及体外诱导分化能力,为进一步深入研究BMSCs的诱导分化和应用打下试验基础。1.麻用全骨髓法分离BMSCs,根据骨BMSCs在培养瓶中贴壁生长的特点,通过传代培养来纯化已分离到的BMSCs,体外培养至第3代,获得纯度较高的BMSCs对分离纯化的第3代兔BMSCs进行形态学观察和细胞表面特异性标志物鉴定,得出兔BMSCs表面标志CD90、CD44阳性表达,CD34阴性,进一步证实了本法所得到的纯化细胞即为兔BMSCs,为进一步的试验研究奠定基础。结论：全骨髓法能够成功分离得到纯度较高的兔BMSCs2.采用二甲基亚砜联合高浓度葡萄糖对分离纯化的第3代兔BMSCs进行体外诱导,观察诱导前后细胞形态学变化,结果试验组在诱导7d出现细胞团样集落,10d获得排列紧密的细胞团,而对照组细胞始终未见细胞团；用双硫腙染色法鉴定细胞团,结果显示,试验组为阳性：用免疫细胞化学法检测细胞内胰岛素的表达,试验组显示阳性；用El. ISA法检测分泌到培养液中的胰岛素含量,结果显示,试验组7d、10d的胰岛素含量分别为(27.82±0.43)mU/L、(27.89±0.25)mU/L,与对照组的(23.39±0.20)mU/L、(25.71±0.27)mU/L比较,差异极显著(P<0.01)。结论：二甲基亚砜联合高浓度葡萄糖能够在较短的周期内诱导出胰岛细胞。3.采用含有10ng/ml. bFGf、10ng/mL EGF、2%B27的DMEM/F-12培养液对BMSCs诱导6d用含10ng/mL HGF、10ng/ml. BTC、10ng/mL活化素A,10mmol/1尼克酰胺、2%B27的H-DMEM培养液对BMSCs诱导6d,结果试验组BMSCs细胞收缩并相互聚集成圆型细胞团,对照组未见细胞团；经双硫腙染色,试验组显示阳性,显示试验组细胞具被胰岛细胞富含锌离子的典型特征；经免疫细胞化学染色,试验组结果为阳性,显示诱导后的BMSCs具备分泌胰岛素的能力。结果显示经本方法所诱导出细胞团细胞为胰岛细胞。结论：应用细胞生长因子联合作用能够诱导BMSCs分化为胰岛细胞。4.将分离纯化的BNSCs分为7组,分别标记为a、b、c、d、e、f、g组,其中a组为对照组,自始至终用含10%FBS的DMEM/F-12培养基进行培养；b组先用无血清、含1%DMSO的DMEM/F-12诱导3d,再用H-DMEM培养基进行刺激培养：c、d、e、f组在b组的基础上分别在第1、3、7、10d加入10mmol/L(?)尼克酰胺：g组用只含10mmol/L尼克酰胺的DMEM/F-12培养基进行诱导。诱导后,在b、c、d、e、f组均有胰岛细胞团出现,双硫腙染色呈阳性,g组有轻微的细胞聚团现象,双硫腙染色呈现弱阳性,a组未见细胞团,双硫腙染色阴性；ELISA检测结果显示,a纠胰岛素分泌量与b、c、d、e、f组均差异显著,而与g组差异不显著。结论：尼克酰胺不能独立诱导BMSCs分化为胰岛细胞,但是尼克酰胺与DMSO配合使用能够促使诱导分化的胰岛细胞分泌更多的胰岛素。