间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)移植治疗冠心病心肌梗死已被广泛研究,结果显示可以通过心肌细胞再生、血管新生及旁分泌作用等改善心功能,发挥有利作用。目前常用的MSCs来源以骨髓为主,然而其存在容易老化、增殖差、伦理学限制等缺点,而脐血MSCs可以克服上述缺点,成为新的移植治疗的细胞选择。目前脐血MSCs在缺血性心肌病中的研究较为充分,治疗扩张型心肌病的相关研究则比较少见,归根结底,其临床应用主要受限于匮乏的基础研究。为了研究脐血MSCs在扩张型心肌病治疗中的疗效和机制,并重点探索旁分泌机制在其中的作用及药物干预MSCs抗缺氧诱导凋亡的研究。我们体外优化分离和培养脐血MSCs的方案；利用缺氧无血清诱导MSCs凋亡,模拟细胞移植后缺血心肌微环境,观察药物曲美他嗪干预对其凋亡的影响和机制；进一步利用缺氧无血清处理h9c2心肌细胞,模拟心肌梗死的心肌微环境,利用脐血MSCs条件培养基干预,观察其抗凋亡作用和机制,体外证明旁分泌作用；最终通过脐血MSCs移植cTnTR141w转基因扩张型心肌病小鼠,分析对心功能的影响及抗凋亡、血管新生、旁分泌等机制作用。研究内容主要包括如下4个部分第一部分脐血MSCs的优化分离、培养及鉴定1、脐血MSCs分离和培养。收集脐血,密度梯度离心法分离脐血单个核细胞,根据不同细胞差速贴壁法进行脐血MSCs分离,比较不同胎龄、血清浓度、首次换液时间等对提取成功率的影响。结果显示影响MSCs提取的因素有：血清浓度,首次换液时间,胎龄,其中10%血清浓度,首次换液时间5天,小胎龄(≤37周)具有更高的分离成功率。2、脐血MSCs鉴定。利用形态学、诱导分化和细胞表面标记物进行三方面鉴定。分别采用成骨、成脂肪诱导分化培养基,培养2-3周,观察成骨、成脂肪分化的表现。取第3代MSCs利用流式细胞技术进行表面标记CD34、CD44、CD45、CD105的表达鉴定。结果显示(1)形态学：原代培养3-4周出现长梭形,形态均一转圈样生长的细胞；(2)诱导分化：成骨及成脂诱导分化3周,茜素红染色阳性,油红O染色大量脂肪滴空泡；(3)表面标记鉴定：流式细胞鉴定显示MSCs几乎不表达造血类标记物CD34、CD45,高表达间充质样标记物CD44、CD105。第一部分结果小结：利用优化分离培养方案,提高了脐血MSCs培养成功率,缩短了培养时间,经形态学、诱导分化及表面标记鉴定显示成功分离MSCs,为下一步的细胞及动物实验奠定了基础。第二部分曲美他嗪抑制缺氧无血清诱导的脐带MSCs凋亡1、脐带MSCs的分离和鉴定。知情同意收集脐带,充分剔除动静脉,利用组织贴壁法分离培养。结果显示随着时间增加,贴壁细胞数目逐渐增多,接种培养一周后,有少许长梭形细胞克隆,逐渐增多,2周时,典型的MSCs克隆形成,可消化传代。进一步利用形态学、诱导分化和细胞表面标记物进行鉴定,显示成功分离脐带MSCs。2、缺氧无血清诱导脐带MSCs凋亡。利用缺氧无血清处理脐带MSCs 12小时,制备模拟干细胞移植到心肌微环境的模型,Hoechst33342染色和流式细胞技术(Annexin V/PI双染)分析细胞凋亡,结果发现缺氧无血清处理诱导了脐带MSCs凋亡。3、曲美他嗪对缺氧无血清诱导的MSCs凋亡具有保护作用。曲美他嗪干预缺氧无血清环境下脐带MSCs, Hoechst33342染色和流式细胞技术(Annexin V/PI双染)分析细胞凋亡水平。结果发现曲美他嗪能够明显抑制缺氧无血清诱导的细胞凋亡,同时能够促进MSCs增殖和生存,表明曲美他嗪对缺氧无血清诱导的MSCs凋亡具有保护作用。4、曲美他嗪可以抑制缺氧无血清处理MSCs的Caspase-3活性。利用Western-blot方法检测曲美他嗪干预的脐带MSCs在缺氧无血清诱导12小时后Caspase-3的表达。结果显示曲美他嗪干预组MSCs的Caspase-3的表达明显低于未干预组,表明曲美他嗪可以抑制缺氧无血清刺激下Caspase-3的表达,提高了MSCs的抗凋亡能力。5、曲美他嗪上调了缺氧无血清处理MSCs的p-Akt的表达。Western-blot检测MSCs中p-Akt的表达水平,结果发现缺氧无血清能够下调p-Akt的表达水平,而曲美他嗪干预后能够促进p-Akt的表达,进一步给予Akt抑制剂LY294002干预,显示可以降低p-Akt的表达,同时增加了凋亡。如上结果提示曲美他嗪可能通过激活p-Akt来抵抗缺氧无血清诱导的MSCs凋亡。6、曲美他嗪处理促进了MSCs的旁分泌作用。蛋白芯片技术检测缺氧无血清条件下曲美他嗪干预组与未干预组MSCs条件培养基细胞因子的差异,结果发现,曲美他嗪能够促进MSCs旁分泌作用,分泌大量抗凋亡、抗炎及再生因子等。提示曲美他嗪促进了MSCs生存,分泌更多的旁分泌因子。第二部分结果小结：缺氧无血清环境诱发了脐带MSCs凋亡,曲美他嗪不仅能够提高缺氧无血清处理后MSCs的存活能力,还通过抑制Caspase-3的活化、提高p-Akt的表达,有效抵抗缺氧无血清诱导的MSCs凋亡。提示曲美他嗪是能够提高MSCs移植后存活能力的有效药物。第三部分脐血MScs条件培养基抗缺氧无血清诱导h9c2心肌细胞凋亡的研究1、缺氧无血清诱导h9c2心肌细胞凋亡。利用缺氧无血清处理h9c2心肌细胞24小时制备心肌梗死模型,Hoechst33342染色和流式细胞技术(Annexin V/PI双染)分析细胞凋亡情况,结果发现缺氧无血清处理诱导了h9c2心肌细胞凋亡2、脐血MSCs条件培养基对缺氧无血清诱导的h9c2心肌细胞凋亡具有保护作用。脐血MSCs条件培养基干预缺氧无血清处理的h9c2细胞24小时,Hoechst33342染色和流式细胞技术(Annexin V/PI双染)分析凋亡水平。结果发现脐血MSCs条件培养基能够明显抑制缺氧无血清诱导的h9c2心肌细胞凋亡,促进其生存,表明脐血MSCs条件培养基对缺氧无血清诱导的h9c2心肌细胞凋亡具有保护作用。3、脐血MSCs条件培养基上调了缺氧无血清处理h9c2心肌细胞p-Akt的表达。Western-blot检测h9c2细胞中p-Akt的表达水平,结果发现缺氧无血清能够下调p-Akt的表达,而脐血MSCs条件培养基干预能够促进h9c2心肌细胞p-Akt的表达。进一步给予Akt抑制剂LY294002干预,显示h9c2心肌细胞凋亡增加,这种条件培养基的保护作用消失,如上结果提示脐血MSCs条件培养基可能通过激活p-Akt来抵抗缺氧无血清诱导的h9c2心肌细胞凋亡。4、脐血MSCs条件培养基含有更多的旁分泌保护因子。蛋白芯片分析MSCs条件培养基的成分,结果显示与普通培养基比较,脐血MSCs条件培养基含有更多的旁分泌因子,如抗凋亡因子,抗炎因子等,提示MSCs条件培养基的保护性作用。第三部分小结：缺氧无血清的恶劣环境诱发h9c2心肌细胞凋亡,脐血MSCs条件培养基能够提高缺氧无血清处理后MSCs的存活能力,通过提高p-Akt的表达,有效抵抗缺氧无血清诱导的h9c2心肌细胞凋亡,进一步蛋白芯片检测提示MSCs条件培养基含有多种旁分泌因子,可能是发挥抗凋亡作用的原因。综上,提示脐血MSCs条件培养基是能够提高h9c2心肌细胞存活的旁分泌机制的体现。第四部分脐血间充质干细胞治疗cTnTR141w转基因扩张型心肌病小鼠疗效和机制研究1、脐血MSCs移植至转基因扩张型心肌病小鼠。雄性cTnTR141w转基因小鼠扩张型心肌病模型,随机分为4组： (A)Control:正常对照组； (B)DCM：扩张型心肌病组；(C)DCM+PB S组：心肌注射PBS; (D) DCM+MSC组：心肌注射MSCs。每组n=6,细胞注射量1.5×106,心肌局部3个点注射。注射前转染绿色荧光蛋白eGFP至MSCs,构建eGFP-MSCs,观察MSCs移植后的命运。2、脐血MSCs移植未发现新生心肌细胞。 (D)组小鼠在移植1月后取心脏制备冰冻切片,免疫荧光显微镜及共聚焦显微镜观察移植MSCs的变化,显示移植心肌局部散在绿色荧光标记的MSCs,但进行相关的心肌细胞标记物染色未发现阳性表达,提示MSCs移植后少部分存活,但未能参与心肌细胞新生。3、脐血MSCs能够改善扩张型心肌病小鼠心功能。各组小鼠在MSCs移植后1月进行超声心动图检查,评价左室功能。结果显示扩张型心肌病小鼠心脏功能下降,表现为扩大的左心室和下降的EF,FS。移植治疗之后,EF和FS增加,心功能改善。4、脐血MSCs抑制小鼠心肌细胞凋亡和心肌组织纤维化。小鼠在MSCs移植1月处死后取心肌组织进行切片,TUNEL染色检测移植后心肌细胞凋亡的水平。结果显示MSCs移植组心肌细胞的凋亡率明显低于(B)(C)组；且通过心肌组织Masson染色显示MSCs移植组心肌组织纤维化水平明显减低。5、脐血MSCs促进了心肌再生因子表达和血管新生。MSCs移植后1月提取心肌组织蛋白上清,利用ELISA检测细胞再生因子IGF-1、VEGF的表达,显示MSCs移植组再生因子表达明显升高,进一步心肌组织a-sma和CD31染色显示新生血管增加。6、体外MSCs条件培养基抑制缺氧无血清诱导h9c2细胞凋亡,进一步证实旁分泌作用。利用MSCs条件培养基干预缺氧无血清条件下的h9c2,心肌细胞,显示条件培养基降低了缺氧无血清诱导的h9c2心肌细胞凋亡,且缺氧预处理的MSCs条件培养基进一步降低h9c2心肌细胞凋亡；从体外细胞实验进一步验证MSCs旁分泌作用。第四部分结果小结：脐血MSCs,心肌移植能够提高cTnTR141w转基因小鼠扩张型心肌病心功能,这与其抗心肌细胞凋亡、降低心肌纤维化、促进血管新生、旁分泌作用等机制相关。本研究分析了(1)细胞实验模拟心肌梗死微环境,观察MSCs条件培养基对h9c2心肌细胞凋亡影响,探讨MSCs旁分泌作用机制。(2)药物(曲美他嗪)干预观察对缺氧无血清环境诱导脐带MSCs凋亡的影响,明确曲美他嗪抗恶劣环境下MSCs的凋亡,促进存活的作用。(3)进一步脐血MSCs心肌移植到转基因小鼠扩张型心肌病模型,观察其疗效和机制,为MSCs治疗扩张型心肌病提供了新的基础实验依据。鉴于脐血MSCs自身优势(取材无创、增殖分化强、无伦理学限制等),进一步临床治疗心血管疾病具有广阔的应用前景。