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小鼠IFRG15(Interferonresponsivegenes15,IFRG15)是干扰素α诱导的核内应答基因,能编码含131个氨基酸,加工后起抑制病毒复制的功能。有研究表明,IFRG15在小鼠2-cell克隆胚、兔植入前克隆胚中存在差异性表达,推测该基因的表达异常是体细胞克隆胚胎发育率低下的一种可能原因。但关于正常小鼠植入前胚胎及出生后不同组织中该基因的表达规律尚未见相关报道。本实验主要在mRNA水平上利用Real-timePCR方法研究了IFRG15在小鼠体内、外植入前各期胚胎及出生后不同周龄几种组织中的表达规律,同时初步探究了植入前胚胎中该基因的表达量与组蛋白乙酰化之间的关系。
首先通过比较实验室现有的两种胚胎体外培养基,进行体外培养系统的优化;采用不同体外精子获能时间、卵母细胞卵龄、卵丘细胞的有无,建立最佳体外受精系统;通过TSA处理体外受精原核受精卵,获取组蛋白乙酰化异常胚胎;最后利用Real-timePCR方法分析了体内、体外、TSA处理的各期胚胎中IFRG15的表达规律;利用一步法RT-PCR分析IFRG15在出生后2、5、16周龄雌雄小鼠心、肝、脾、肺、肾、肌肉及生殖器官(卵巢或睾丸)7种组织中的表达规律。
通过上述方法我们得知,在实验室现有条件下CZB培养基更适合小鼠胚胎体外培养;体外受精在前人的基础上进行了关键步骤的改进,即将精子置于24孔板内进行体外获能1.5h后与注射hCG后13.5h的卵丘卵母细胞复合体共孵育6h的原核率及胚胎发育质量最好:Real-timePCR结果显示体外受精4-细胞期胚胎中IFRG15的表达量最高,同时发现TSA处理组IFRG15的表达量较正常组出现上升趋势,说明组蛋白高度乙酰化对该基因的表达有上调作用;随后对出生后不同周龄雌雄小鼠的7种组织中的表达水平进行了跟踪检测,发现在肺脏组织和生殖器官中的表达存在选择性表达差异。
本实验首次对IFRG15在小鼠体内、外受精植入前胚胎、TSA处理胚胎中的表达规律进行了系统的分析,为优化体外培养环境,提高体外胚胎发育质量,揭示IFRG15在小鼠植入前胚胎中的作用提供理论参考;同时还对出生后不同周龄的雌雄小鼠中7种组织的表达水平进行了跟踪检测,首次获得该基因在后期发育过程中的表达谱,为了进一步研究该基因的生物学功能奠定基础。