在雌性哺乳动物中大约有70％-99％的卵泡发生闭锁，而卵巢闭锁的实质就是颗粒细胞凋亡。Smad4是Smad蛋白家族中唯一的一个共介导型Smad，在TGF-β/Smad及BMP/Smad信号通路中起到中心元件的作用。研究发现Smad4在哺乳动物卵巢颗粒细胞的增殖、分化、卵泡发育和繁殖性能等方面发挥重要作用，特异性敲除卵巢Smad4基因后小鼠卵巢异常，表现出严重的卵丘细胞异常和颗粒细胞提早黄体化。最近研究发现miRNAs在哺乳动物卵泡细胞凋亡中起到重要的调控作用，但目前关于猪Smad4基因及其调控miRNAs方面的研究较少。本实验以二花脸猪为研究对象，采用克隆测序技术获得二花脸猪Smad4基因编码区序列;利用生物信息学方法分析其序列特征及蛋白结构;运用RT-PCR技术和免疫组化方法检测Smad4的组织表达特征和卵巢组织细胞表达特征;采用real-time PCR技术和Western blot技术检测二花脸猪和商品猪卵巢组织中Smad4基因和蛋白表达水平差异;利用RNAi技术分析了Smad4在猪卵巢颗粒细胞凋亡中的作用;通过构建Smad4-3UTR荧光素酶报告载体验证miR-26b是猪Smad4的调控miRNA;采用流式细胞仪、real-time PCR技术和Western blot技术分析miR-26b靶向Smad4对猪卵泡颗粒细胞凋亡的调控作用。研究结果为揭示二花脸高繁殖力性状形成的分子机制提供参考和理论依据。本文主要研究结果如下:　　1.二花脸猪Smad4基因编码区序列分析　　通过克隆测序获得了二花脸猪Smad4基因编码区序列，全长为1659bp。二花脸猪Smad4基因定位在1号染色体第104431-104486kb之间(GenBank序列号:NC_101443.3)。同源性分析发现二花脸猪Smad4基因核苷酸序列与哺乳动物其它物种的一致在86％以上。二花脸猪Smad4基因编码蛋白含552个氨基酸残基，与哺乳动物的一致性在84-98％之间。结构域预测发现二花脸猪Smad4蛋白与哺乳动物其它物种一样，也含有3个保守的结构域，即MH1结构域、SAD结构域和MH2结构域。三级结构预测显示二花脸猪Smad4蛋白含有7个α螺旋、12个β折叠和一些无规则卷曲。以斑马鱼为外类群，构建了哺乳动物NJ系统发育树，发现聚类结果与经典的分类学吻合。研究结果表明二花脸Smad4基因与哺乳动物其它物种在进化上相当保守，推测二花脸猪Smad4基因与其它哺乳动物一样在繁殖力和颗粒细胞凋亡等方面发挥重要作用。　　2.二花脸猪Smad4基因表达特征与卵巢组织表达水平　　采用RT-PCR方法检测Smad4基因在二花脸猪小肠、肝脏、脑、心脏、肾脏、脾、子宫和卵巢组织的表达情况，结果发现Smad4基因mRNA在二花脸猪的8种组织中均有表达，说明猪Smad4基因是一个广泛表达的基因。免疫组化分析发现Smad4基因在猪卵泡的各个发育阶段均有表达，主要分布在卵母细胞和颗粒细胞中。real-time PCR检测发现二花脸猪卵巢组织中Smad4基因mRNA表达水平极显著高于杜长大猪(P＜0.01)。Western blot检测发现二花脸猪卵巢组织中Smad4蛋白表达水平显著高于杜长大猪(P＜0.05)。　　3.Smad4在猪卵泡颗粒细胞凋亡中的作用　　用Smad4-siRNA转染猪的卵巢颗粒细胞，转染后48h，利用real-time PCR技术检测Smad4基因的mRNA表达水平，结果发现颗粒细胞中Smad4基因mRNA水平下调了72.44％，差异极显著(P＜0.01);转染72h后，利用western blot技术检测蛋白水平，结果发现Smad4蛋白水平下降41.67％，差异极显著(P＜0.01)，说明Smad4-siRNA可有效的抑制猪颗粒细胞中Smad4基因的表达。转染后48h，流式细胞仪检测发现细胞凋亡率显著升高(P＜0.05);凋亡相关基因Bcl-2 mRMA表达量显著下降(P＜0.05)，但Bax表达量变化不显著，说明抑制Smad4可促进猪卵泡颗粒细胞凋亡。　　4.miR-26b对猪Smad4基因的靶向调控作用　　根据生物信息学网站预测，结合课题组前期利用miRNA芯片检测猪卵泡闭锁过程中miRNA表达谱，结果发现miR-26b既是Smad4基因的候选调控miRNAs，也是猪卵泡闭锁过程中差异表达的miRNA。将miR-26b mimics和构建的smad4基因3UTR荧光素酶报告基因载体共转染Hela229细胞，转染24h后检测荧光素酶活性，结果发现转染miR-26b mimics后组报告基因的活性极显著低于对照组（mimics NC组）(P＜0.01)，说明过表达miR-26b可极显著抑制报告基因的活性，验证了miR-26b对猪Smad4基因具有调控作用，是猪smad4基因的调控miRNA。　　5.miR-26b靶向Smad4基因对猪卵泡颗粒细胞凋亡的调控作用　　离体培养猪卵泡颗粒细胞，利用Lipofectamine TM RNAiMAX将miR-26b mimics和阴性对照mimics NC转染猪卵泡颗粒细胞，48小时后检测Smad4基因mRNA表达水平，结果发现Smad4转录水平下降14.60％，差异极显著(P＜0.01)。颗粒细胞中凋亡相关基因Bcl-2基因mRNA表达水平显著下调(P＜0.05)，但Bax基因表达水平无显著变化。72h后Western blot检测发现Smad4蛋白表达水平下降80.38％，差异极显著(p＜0.01)。48h后流式细胞仪技术检测发现细胞凋亡率显著上升(P＜0.05)。研究结果说明miR-26b可以通过靶向Smad4基因调控猪卵泡颗粒细胞凋亡。