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蜂蜜是蜜蜂采集植物花蜜或植物活体分泌物或在植物活体上吮吸蜜源昆虫排泄物等生产的天然甜味物质,与其自身分泌的特殊物质结合转化、沉积、脱水、贮藏并留存于蜂巢中直至成熟。蜂蜜含有糖、酚类化合物、蛋白质、酶等对身体健康有益的化合物。蜂蜜的生产过程是及其复杂的生物转化过程,花蜜转化为蜂蜜的机制,既是蜂蜜生产的起点,又直接反应其真实性的途径,故明确蜂蜜成熟过程中物质变化十分必要。本研究采用高效液相色谱-蒸发光散射法(High performance liquid chromatography with evaporative light-scattering detection,HPLC-ELSD)对6种蜂蜜成熟过程中糖的变化及油菜盛花期花蜜不同时间段糖类物质的组成进行检测,并通过qRT-PCR检测油菜花蜜腺成熟过程和盛花期不同采集时段与花蜜形成的关键基因的表达,以此了解盛花期不同时间段糖类物质组成的差异的分子机制。本文主要的研究内容和结果如下:1.建立了标准品结合HPLC-ELSD分析蜂蜜中糖类物质的方法。该法呈现了很好的方法重复性(RSD为0.04-0.144%)、精密度(RSD为0.013-0.078%)和稳定性(RSD为0.081-0.159%);6种糖类物质的高、中、低浓度的加标回收率为 105.89-115.37%、96.02-106.09%、92.14-98.84%,说明本方法重复性好,准确度高。2.采用建立的HPLC-ELSD方法,分别以油菜和洋槐的花蜜、蜜囊蜜、水蜜和成熟蜜为实验材料,研究其成熟过程中糖的变化规律。HPLC-ELSD从中测出了果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖和未知峰(保留时间为24.35 min),这些糖的总含量在成熟过程中呈现上升的趋势。在洋槐花蜜中蔗糖含量高达52.14 g/100g,随着蜜蜂分泌的α-葡萄糖苷酶等消化酶的加入,蔗糖不断被转化为果糖和葡萄糖,所以蔗糖含量由52.14g/100g逐渐降低至1.39 g/10.0g,果糖和葡萄糖含量由18.33 g/100g逐渐升高至72.79 g/100g。油菜蜜和洋槐蜜的变化趋势一致,在蜂蜜成熟过程中糖物质越来越丰富,其不同的是油菜花蜜中果糖和葡萄糖含量较高,分别为11.68g/100g和11.16g/100g,而蔗糖含量较低,为1.2 g/100g,这是由于植物为了适应访花者的觅食喜好而产生的生物进化,但单糖:蔗糖的比值仍能说明蔗糖不断被水解为果糖和葡萄糖。脐橙、蜜桔、椴树和油茶蜂蜜成熟过程中除了检测到果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和海藻糖,还检测到蜜二糖,其变化趋势与洋槐蜂蜜成熟过程的变化趋势一致。上述结果均表明成熟蜜中的糖物质具复杂性及多样性,成熟蜜更优质。3.利用HPLC-ELSD首次明确了欧洲油菜花蜜中糖的日变化规律。随着时间的延长,花蜜的含水量从92.15%到37.84%显著下降;14:00点之前仅检测到果糖和葡萄糖,二者含量依次为:6.81 g/100g、15.23 g/100g、16.2 g/100g 和 17.45 g/100g,而从16:00开始,开始从花蜜中检出蔗糖(1.18±0.15g/100g)。4.以 8:00、10:00、12:00、14:00、16:00 和 18:00 时采集的欧洲油菜盛花期的蜜腺为实验材料,利用qRT-PCR检测不同采集时段与蜜腺分泌花蜜的相关基因的表达。BrSBE2-1,BrMYB305和BrAMY3基因相对表达含量呈现先上升后下降的趋势,16:00时达到峰值,因此在16:00时较其它时间段也产生较多合成蔗糖的原料,在蔗糖合成相关的BrSUS5和BrSPS2等酶的作用下,淀粉降解产物被重新合成蔗糖;随后蔗糖被其载体BrSWEET9转运到蜜腺开口附近的细胞间隙中,而BrCWINV4全天表达量比较平稳,在16:00时蔗糖被大量转运到细胞间隙中,BrCWINV4不能及时将大量的蔗糖水解成果糖和葡萄糖,蔗糖随着果糖、葡萄糖和水一起通过蜜腺表面开放的气孔分泌到蜜腺外部,从而形成花蜜。因此,在16:00时从欧洲油菜花蜜中能检测到少量的蔗糖,而其它时段未检测到蔗糖。综上所述,蜂蜜成熟过程中主要发生的变化为蔗糖水解为果糖和葡萄糖,随着蜜蜂的不断加工,蜂蜜的成分也越来越复杂。利用HPLC-ELSD首次明确了欧洲油菜花蜜中糖的日变化规律。利用qRT-PCR技术分析欧洲油菜蜜腺分泌蔗糖的相关基因的表达,从而初步阐明在16:00时左右从欧洲油菜花蜜中检测到蔗糖的内在分子机制。本研究为理解蜂蜜成熟过程中糖的变化规律以及提高花蜜合成和分泌的分子水平调控的认识提供重要的参考价值。