论文部分内容阅读
目的:观察FUT7及SLe~X在肝癌组织中的表达,探讨其与肝癌临床病理特征的关系,观察FUT7siRNA对SLe~X表达对肝癌细胞增殖的影响,并探讨其机制。研究方法:1、选取2017年1月至2018年1月在中国医科大学附属第一医院及锦州医科大学附属第一医院56例原发肝细胞癌手术切除标本及其配对癌旁组织,术中即时取样后再液氮罐中留存。采集标本对应患者的信息(年龄、血管浸润、HBsAg、AFP、性别、肝硬化、TNM分期(UICC第七版)、肿瘤直径、分化程度等),用免疫组化、qRT-PCR及Western Blot检测FUT7及SLe~X在组织中蛋白水平及mRNA水平表达,并观察其与临床病理特征的关系,Pearson Rank检验二者在蛋白水平的相关性。2、流式细胞术检测人肝癌细胞(QGY7703和MHCC97)及正常肝细胞系(THLE-2)细胞表面SLe ~X抗原表达。3、qRT-PCR及Western Blot检测FUT7在QGY7703和MHCC97细胞及THLE-2细胞中蛋白水平及mRNA水平表达。4、给予不同的SLe单克隆抗体抑制MHCC97细胞及正常肝细胞表面的SLe抗原,采用MTT法检测细胞生长曲线。5、使用特异性siRNA敲除QGY7703和MHCC97细胞中的FUT7表达,qRT-PCR及Western Blot检测转染效率。MTT检测转染后细胞增殖、流式细胞检测细胞周期、流式细胞检测SLe~X抗原表达。6、在MHCC97细胞,给予PLCγ抑制剂U73122、PKA抑制剂KT5720、ERK抑制剂ErkI、PI3K抑制剂LY294002、CDC25抑制剂CDC25I,抑制PKA、PI3K/AKT及PLCγ/ERK等信号通路,观察对FUT7表达及MHCC97细胞增殖的影响。结果:1、免疫组化检测显示SLe~X及FUT7在肝癌组织阳性表达率高于癌旁组织(P<0.001);Western Blot及qRT-PCR检测显示,SLe ~X及FUT7蛋白及mRNA在肝癌组织中表达均高于癌旁组织(P<0.001)。2、SLe~X在肿瘤数量多发、血管浸润阳性及TNM分期(Ⅲ、Ⅳ期)患者中表达高于肿瘤数量单发、血管浸润阴性及TNM分期(Ⅰ、Ⅱ期)患者(P<0.001;P<0.05;P<0.001)。FUT7在肿瘤数量多发、血管浸润阳性及TNM分期(Ⅲ、Ⅳ期)患者中表达高于肿瘤数量单发、血管浸润阴性及TNM分期(Ⅰ、Ⅱ期)患者(P<0.05;P<0.05;P<0.05)。3、Pearson rank相关分析结果显示,在肝癌组织中,SLe~x与FUT7在蛋白水平的表达呈正相关(r=0.752,95%CI:0.609~0.847,P<0.0001)。4、流式细胞检测显示,与正常肝细胞(THLE-2)组表达比较,SLe~x在人肝癌细胞MHCC97及QGY7703细胞中表达较高(P<0.001)。5、qRT-PCR及Western blot检测显示,FUT7 mRNA及蛋白在MHCC97、QGY7703细胞中表达高于THLE-2细胞,差异有统计学意义(P<0.001)。6、给予不同的SLe单克隆抗体抑制MHCC97细胞及正常肝细胞表面的SLe抗原,采用MTT法检测细胞生长曲线。结果显示,与对照组(PBS组)比较,抗SLe~X单克隆抗体KM93对MHCC97细胞增殖抑制最明显(P<0.05),但对正常肝细胞THLE-2没有明显增值抑制(P>0.05)。7、给予siRNA转染QGY7703及MHCC97细胞下调FUT7表达,以Western blot及qRT-PCR检测转染效率,FUT7蛋白及mRNA在转染siRNA1及siRNA2的QGY7703细胞MHCC97细胞中表达均明显降低(P<0.001)。8、MTT检测显示,给予siRNAs转染细胞48h下调FUT7表达,在QGF7703细胞及MHCC97细胞,与Control及siNC组比较,siRNA-1组及siRNA-2组细胞存活率均下降(P<0.001),下调FUT7表达抑制HCC细胞增殖。流式细胞术检测细胞周期显示,给予siRNA转染细胞48h下调FUT7表达,在QGY7703细胞及MHCC97细胞,siRNA-1组及siRNA-2组停留在S期细胞比例均下降(P<0.05),下调FUT7表达降低HCC细胞在S期比例。给予siRNA转染细胞48h下调FUT7表达,在QGY7703细胞及MHCC97细胞,siRNA-1组及siRNA-2组SLe~X蛋白表达均下降(P<0.05)。9、为了进一步探讨FUT7在肝癌中的作用机制,对FUT7 mRNA水平给予多个信号通路相关蛋白的抑制剂以观察FUT7 mRNA的表达。qRT-PCR检测显示,在MHCC97细胞,PLCγ抑制剂、PKA抑制剂及PI3K抑制剂会明显诱导FUT7 mRNA表达水平下降(P<0.05)。MTT检测显示,在正常肝癌细胞THLE-2,PLCγ及Erk抑制剂均降低细胞增殖(P<0.05;P<0.01)。在MHCCC97细胞,CDC25、PI3K、PLCγ及Erk抑制剂均降低细胞增殖(P<0.05)。PLCγ抑制剂表现出最强的抑制作用。采用siRNA下调FUT7表达,抑制细胞增殖是通过PLCγ实现的。采用Western Blot对PLCγ1及磷酸化的PLCγ1(p-PLCγ1)进行了检测。siFUT7转染后,细胞质内PLCγ1明显下调,细胞膜p-PLCγ也下调。这表明,下调FUT7表达能够抑制PLCγ的易位及磷酸化,抑制PLCγ的激活,进一步验证了FUT7通过激活PLCγ表达影响肝癌细胞的增殖行为。由于Erk是PLCγ信号通路的下游基因,FUT7通过PLCγ/Erk信号通路调控QGY7703及MHCC97细胞增殖。结论:FUT7及SLe~X在肝癌组织中高表达,提示可能与肿瘤的增殖、转移、复发有关。FUT7 siRNA通过调控SLe~X表达抑制肝癌细胞增殖。