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研究背景心肌肥大(cardiac hypertrophy)是心脏对于外界刺激的适应性反应,表现为心肌细胞体积增大,收缩性蛋白合成增加,胚胎发育标志基因心钠素(atrial natriuretic factor,ANF)被重新激活等。尽管心肌肥大最初是以适应心脏超负荷的需求而发生代偿性的变化,但是长期心肌细胞体积的增大往往导致细胞死亡,同时心肌间质细胞如成纤维细胞增殖,使心肌结构紊乱,收缩力降低,最终会导致心功能不全、心力衰竭和猝死等,因此心肌肥大是众多心血管疾病的独立危险因素。但目前还没有治愈心肌肥大的方法,亦缺乏有效的防治手段,临床仍然需要更好的治疗药物。因此,深入探索心肌肥大的分子机制,以期开发安全、高效的抗心肌肥大分子药物是心血管生物学领域的重要课题。心肌能量代谢障碍也是诱导心肌肥大发生的关键因素,其实质在于调节心肌能量代谢关键基因表达的紊乱,而过氧化物酶体增殖物激活受体δ(peroxisome proliferator activated receptor delta,PPARδ)作为心肌能量代谢的关键基因之一,对于心肌能量代谢的调节具有重要意义。因此,从“PPARδ的表达调控”入手,将有利于深入探索心肌肥大发生的分子机制。根据miRNA靶标预测工具Target Scan和Pic Tar,我们发现PPARδ是miR-29a的靶标蛋白。另外,还有研究表明:miR-29a在小鼠胚胎心脏中高表达,并且在心室重塑中发挥重要作用。鉴于此,我们推测:miR-29a在心肌肥大的发生发展中发挥重要作用,并且这种作用与其靶标蛋白——PPARδ有关。针对上述推理,我们进行了本课题的研究工作。研究目的本研究旨在探索miR-29a在心肌肥大发生中的作用机制,及这种作用是否通过“target”PPARδ而实现。该研究将从分子水平阐明心肌肥大的分子机理和病理学基础,同时也为发掘理想的抗心肌肥大药物提供更多线索。方法1.盐酸异丙肾上腺素(isoproterenol,ISO)处理ICR小鼠14d,诱发心肌肥大。超声心动图检测小鼠的左心室短轴缩短率(fractional shortening,FS)、左心室质量(left ventricular mass,LV mass)、舒张期左心室厚度(diastolic left ventricular thickness,LVPWd)、舒张末期左心室内径(end-diastolic and left ventricular internal diameter,LVIDd)和收缩末期左心室内径(end-systolic left ventricular internal diameter,LVIDs)。2.免疫组织化学实验分析ANF、GATA4、PPARδ的蛋白表达。3.Real-time PCR实验检测小鼠心室或原代心肌细胞中miR-29a、U6、S16、ANF、BNF、GATA4、PPARδ、GAPDH的m RNA表达。4.荧光素酶报告基因法分析miR-29a与PPARδm RNA 3’-UTR的结合及ANF启动子的活性。结果1.miR-29a缓解盐酸异丙肾上腺素诱导的心肌肥大。1.1形态学分析结果显示,miR-29a能够逆转ISO诱导的心脏形态改变。1.2超声结果显示,ISO诱导小鼠发生心肌肥大时,miR-29a有效地保护了心功能。1.3 Real-time PCR和免疫组织化学结果显示,miR-29a能够下调心肌肥大相关基因的表达。2.miR-29a可维持心功能并下调ANF的表达。2.1形态学分析结果显示,miR-29a可以维持心脏正常形态。2.2超声结果显示,miR-29a可以维持心功能。2.3 Real-time PCR和免疫组织化学结果显示,miR-29a下调ANF的表达水平。3.miR-29a靶向PPARδ抑制ANF的表达。3.1 Real-time PCR和免疫组织化学结果显示,miR-29a下调PPARδ的表达水平。3.2荧光素酶报告基因法结果显示,miR-29a可以与PPARδ3’-UTR结合,进而下调PPARδ的表达。3.3荧光素酶报告基因法结果显示,PPARδ可以剂量依赖地激活ANF启动子的活性。结论miR-29a之所以能够缓解盐酸异丙肾上腺素诱导的心肌肥大,是因为它能够结合在PPARδm RNA 3’UTR区,从而下调PPARδ的表达,最终使心肌肥大标志基因ANF的表达下调,进而缓解盐酸异丙肾上腺素诱导的心肌肥大。