栉孔扇贝三倍体的诱导及精子形态的研究

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本研究以栉孔扇贝为研究材料,对体外解剖促熟的卵子进行三倍体的诱导和应用一种新方法—高盐诱导多倍体,通过抑制受精卵第二极体(PB2)的排放来诱导栉孔扇贝三倍体,并通过伊红和结晶紫两种染色方法对栉孔扇贝的精子的质量进行评价。探索出了体外促熟后栉孔扇贝卵的三倍体诱导的条件和高盐诱导栉孔扇贝三倍体的最佳诱导条件以及评价栉孔扇贝精子的质量形态的染色方法,为丰富栉孔扇贝的多倍体诱导提供了依据,为多倍体贝类的诱导拓宽了领域。本研究主要有以下几部分:1.体外促熟后栉孔扇贝卵的三倍体诱导的研究在水温19℃左右时,通过对解剖的栉孔扇贝的卵子进行体外促熟后再进行低盐处理获得三倍体。人工解剖雌性栉孔扇贝,得到卵子,将体外解剖的卵在0.005%的氨水处理15min后再用0.002M的5-羟色胺处理45min促熟后再人工受精,设置不同的低渗盐度(S=10、12、14、16)梯度,不同的持续处理时间(15、20、25min)和不同的处理时机(出现第一个第一极体、40%-50%出现第一极体、出现第一个第二极体)进行实验。经过氨海水处理后的卵母细胞生发泡的破裂率达到了90%以上,经过5-羟色胺处理后最终的受精率达到了41.28%。氨海水和5-羟色胺分别促进了生发泡的破裂和提高了生发泡破裂的卵母细胞的受精率。实验得到了在低渗盐度为S=14,受精后持续处理20min,在40%-50%出现第一极体时,三倍体率最高,为54.28±8.48%。2.一种新方法—高盐诱导栉孔扇贝三倍体及与其他方法比较的研究在水温19℃左右时,设置不同的高盐盐度(S=40、42.5、45、47.5、50、52.5)梯度,不同的持续处理时间(10、15、20、25min)和不同的处理时机(出现第一个第一极体(PB1)、40%-50%出现第一极体(PB1)、出现第一个第二极体(PB2))进行实验。获得了在高盐盐度为S=47.5,受精后持续处理20min,在40%-50%出现第一极体时,高盐盐度三倍体率最高,为95.56±2.87%。通过与其他三倍体诱导方法相比较,高盐诱导方法是目前诱导率最高的一种新型、安全的诱导方法。安全无毒、不需特别的装置和购买药品,成本几乎为零,对幼虫和操作者没有毒害作用,因此适于产业化推广。3.不同染色方法对精子形态质量的观察本实验比较了应用伊红、结晶紫两种染液对栉孔扇贝的精子进行染色评价精子质量的方法的差异,采用伊红对精子染色最理想的方法是首先将样品与20mg/ml的伊红染液等比例混合后染色,再涂片的方法进行染色处理,而采用结晶紫对精子染色最理想的方法是用5mg/ml的结晶紫染液采用渗透染色法对精子涂片进行染色。通过对精子的形态特征的统计发现,两种染色方法获得的正常精子的比率没有显著性差异(P<0.05)。但伊红染色统计的尾部弯曲精子的比例较结晶紫的较高,但所占比率较小,不会对总体评价标准造成影响,造成这种情况出现的原因可能是染色方法不同畸形精子出现的程度不同。两种评价栉孔扇贝精子形态的方法数据稳定、客观真实,可以应用于栉孔扇贝精子的形态检测、分析以及生产实践中。
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