研究背景原发性骨肉瘤和癌症骨转移患者多为终末期患者,主要症状之一就是疼痛,这类疼痛又被称为骨癌痛(bone cancer pain,BCP)。BCP患者生活质量受到严重影响,同时对于患者家庭和社会,也是巨大的精神压力和经济负担。在各种类型和各种病因引起的疼痛中,BCP是最为严重、最普遍和最难以控制的病理性疼痛之一。其兼具因肿瘤细胞侵袭导致的神经病理性疼痛和局部炎症介质导致的炎症性疼痛两种特点。临床上常用阿片类药物缓解BCP,但阿片类药物的成瘾性、顽固性便秘等副作用限制了其更广泛应用。寻找一种效果可靠、副作用小的缓解BCP的方法意义重大。对于非癌性慢性疼痛,临床医生采用神经电刺激方法治疗已经取得了一定的疗效。以神经病理性疼痛为特征的多种顽固性慢性疼痛对外周神经电刺激都有一定敏感性。外周神经电刺激(peripheral nerve stimulation,PNS)作用于慢性疼痛时的机制十分复杂,至今尚未完全阐释清楚。可能是通过作用于外周神经A和C纤维在脊髓水平起到镇痛作用:同时降低P物质、去甲肾上腺素、5-羟色胺(5-HT)、GABA等炎症因子释放,多重调控疼痛。不同参数的刺激条件,产生的疼痛治疗效果也不同。因此,选择适宜的电刺激参数意义重大。活性调节细胞骨架相关蛋白(activity-regulated cytoskeleton-associated protein,Arc)与c-fos和Zif268一样都属于早反应家族成员,也被称为arg3.1。Arc特性之一是可以通过外周神经高频(>100Hz)电刺激诱导表达;另外一个特征是在突触的可塑性方面起到至关重要作用,与此同时外周神经电刺激能够在海马回和新皮层等部位诱导Arc表达。本研究拟在建立的大鼠骨癌痛模型中,先利用疼痛行为(热痛行为和机械痛行为)学方法筛选出最佳的外周神经电刺激参数,然后观察脊髓中Arc和GluR1蛋白表达与外周神经电刺激之间的关系,进一步通过鞘内注射Arc shRNA明确Arc在外周神经电刺激治疗骨癌痛中的作用机制。第一部分:大鼠胫骨癌痛模型的构建和评估目的通过对大鼠体重改变情况的观察、热痛和机械痛行为学、胫骨的影像学以及胫骨组织学等方法,构建并评估大鼠骨癌痛模型。方法雌性SD大鼠,体重160-180g,在大鼠右侧胫骨内注射荷瘤鼠(雌性SD新生大鼠,体重60-80g)体内腹水传代Walker256乳腺癌肉瘤细胞,接种Walker256肿瘤细胞后1d、3d、5d、7d、9d、11d、13d、15d和21d观测大鼠体重、状态情况、以及热缩足潜伏期(Thermal withdrawal latency,TWL)和机械缩足阈值(Mechanical withdrawalthreshold,MWT),并在接种肿瘤细胞后第14d,利用放射影像学检测右侧胫骨骨质的破坏情况以及组织形态学(HE染色),显微镜下观察肿瘤的生长情况。结果1.肿瘤细胞植入(Tumor cell implantation,TCI)后第13d大鼠的体重增长速度明显减慢,并且减慢程度呈时间依赖性。2.TCI后第5d大鼠手术测的TWL和MWT值显著降低,并随着时间的推移进一步下降。3.TC后第14d,X线摄片显示,手术侧胫骨近端均呈现出重度骨质疏松的表现,同时骨皮质观察到有明显的缺损,骨组织内部结构不清晰,骨组织破坏程度相关评分显著增高;胫骨组织病理学检测显示,病变骨髓腔内填充满了大量核大且深染的肿瘤细胞,肿瘤细胞生长状态活跃,两侧的骨皮质和骨髓质都呈现出显著的破坏。小结TCI大鼠热痛敏和机械痛敏显著,胫骨骨质破坏严重,骨髓腔内的肿瘤细胞增生活跃,大鼠胫骨癌痛模型建立成功。第二部分:不同参数下外周神经电刺激对骨癌痛的影响目的通过疼痛行为学观察不同参数(主要包括频率、强度和作用时间)的外周神经电刺激对骨癌痛的作用,筛选出治疗骨癌痛的最佳参数。方法神经电刺激参数主要包括刺激的频率、强度和刺激作用时间,我们选取以高中低(120Hz、60Hz、10Hz)刺激频率、高中低(0.1mA、0.3mA、0.6mA)刺激强度和长中短(40min、20min、1Omin)刺激时间的参数组合,刺激第7天(第7天骨癌痛模型大鼠已发生明显的痛行为改变)骨癌痛大鼠的坐骨神经,通过热痛和机械痛等指标观察不同电刺激组合对骨癌痛的作用。结果1.在刺激强度和作用时间一定的条件下,60Hz,120Hz频率的神经外周电刺激对骨癌痛大鼠的热痛敏和机械痛敏有明显抑制作用,同时120Hz组的抑制作用要强于60Hz组,但差异不具有显著性,10Hz频率对骨癌痛大鼠的疼痛行为学没有明显的作用。2.在刺激频率和作用时间一定的条件下,0.3mA,0.6mA强度的外周神经电刺激对骨癌痛大鼠的热痛敏和机械痛敏有明显缓解作用,同时两者的缓解作用没有显著的差异,而0.1mA强度电刺激对骨癌痛大鼠的疼痛行为学没有明显的作用。3.在刺激强度和作用时间一定的条件下,10min,20min,40min作用时间的神经外周电刺激对骨癌痛大鼠的热痛敏和机械痛敏行为都有明显抑制作用,同时20min,40min的抑制作用要明显强于1Omin,而20min,40min之间的抑制强度没有明显的差异。小结60Hz,0.3mA以及20min分别是频率,强度以及作用时间三个参数中治疗骨癌痛的最佳参数。第三部分:脊髓Arc-GluR1在外周电刺激缓解骨癌痛中的作用目的观察Arc,GluR1在外周神经电刺激治疗骨癌痛中的作用。方法通过蛋白免疫印迹和免疫组化方法,检测不同频率下的外周神经电刺激对正常大鼠和骨癌痛大鼠脊髓中的Arc,GluR1和pNR2B蛋白水平表达的影响。为了进一步明确Arc,GluR1在外周神经电刺激治疗骨癌痛的作用,电刺激前一天鞘内注射携带Arc shRNA的慢病毒颗粒,Real-time PCR以及蛋白免疫印迹方法检测脊髓中Arc mRNA和蛋白的干扰效果;同时利用热痛和机械痛行为学方法以及蛋白免疫印迹方法,观察鞘内注射Arc shRNA后对骨癌痛大鼠的镇痛的影响以及脊髓Arc,GluR1表达的影响。结果1.60Hz和120Hz刺激下,正常大鼠脊髓中Arc蛋白表达显著增强并且主要分布在脊髓背角Ⅰ-Ⅱ层的中部区域,GluR1蛋白表达水平明显降低,同时60Hz和120Hz两组之间对Arc和GluR1的表达没有明显差异;10Hz的电刺激对Arc和GluR1的表达没有显著的影响;pNR2B蛋白的表达在整个电刺激过程没有发生明显变化。2.在骨癌痛模型大鼠上,60HZ和120Hz频率的电刺激下进一步诱导Arc蛋白的表达,同时显著降低了 GluR1的表达,对pNR2B的表达没有明显改变。3.鞘内注射Arc shRNA后,骨癌痛大鼠脊髓中Arc mRNA和蛋白表达明显降低。鞘内注射Arc shRNA后,60Hz外周神经电刺激缓解骨癌痛的作用被抵消,同时抑制了电刺激诱导Arc的表达,GluR1蛋白表达增强。小结外周神经电刺激能够在正常大鼠和骨癌痛大鼠脊髓上诱导Arc蛋白的表达,抑制GluR1的表达;鞘内注射Arc shRNA能够抑制外周神经电刺激对骨癌痛的镇痛作用,降低脊髓Arc表达,与此同时GluR1表达增多。结 论一.TCI大鼠热痛敏和机械痛敏显著,胫骨骨质破坏严重,骨髓腔内的肿瘤细胞增生活跃,大鼠胫骨癌痛模型建立成功。二.60Hz,0.3mA以及20min分别是频率,强度以及作用时间三个参数中治疗骨癌痛的最佳参数。三.外周神经电刺激能够在正常大鼠和骨癌痛大鼠脊髓上诱导Arc蛋白的表达,抑制GluR1的表达;鞘内注射Arc shRNA能够抑制外周神经电刺激对骨癌痛的镇痛作用,降低脊髓Arc表达,与此同时GluR1表达增多。