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口蹄疫(Foot and mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒(FMD virus, FMDV)所致的一种偶蹄动物共患的急性、热性、高度接触性传染病,该病的暴发会给国家带来巨大的经济和政治影响。传统疫苗在该病的防治过程中虽然起着举足轻重的作用,但其本身产生的副作用使得安全高效新型FMD疫苗的研制成为了必要。目前,最常见的新型FMD疫苗是生物合成多肽疫苗。多肽疫苗具有安全稳定、易于生产、针对性强的优点,但免疫原性一般较差。因此,使用多肽疫苗进行免疫时加入合适的佐剂是必不可少的。本研究从细胞因子佐剂的研究出发,将牛IL-2、IFN-γ真核表达质粒和牛IFN-γ成熟蛋白(pr-mBoIFN-γ)分别同Asia1型FMDV G-H环多肽(FMDV VP1蛋白137-158aa)融合蛋白联合免疫小鼠,观察重组牛IL-2和IFN-γ对FMDV G-H环多肽免疫效果的影响。本研究对G-H环多肽融合蛋白(G-H)及pr-mBoIFN-γ进行了原核表达并纯化,构建了含有信号肽序列的牛IL-2和牛IFN-γ真核表达质粒pcDNA3.1-pBoIL-2和pcDNA3.1-pBoIFN-γ。为了检测构建的真核表达质粒是否能在哺乳动物细胞内正常表达,将两种质粒和空载体pcDNA3.1分别转染BHK21细胞并利用间接免疫荧光试验体外鉴定其表达。结果显示,pcDNA3.1-pBoIL-2和pcDNA3.1-pBoIFN-γ转染后的细胞出现了明亮的绿色荧光,而空载体转染后的细胞则没有荧光出现,这说明真核表达质粒pcDNA3.1-pBoIL-2和pcDNA3.1-pBoIFN-γ在BHK21细胞中进行了成功表达。将两种细胞因子的真核表达质粒和pr-mBoIFN-γ分别与G-H组合免疫昆明鼠,并设立阴阳性对照。用间接ELISA试验和病毒中和试验(Virus Neutralization Test, VNT)检测免疫鼠的体液免疫状况。结果显示,首次免疫后各组小鼠血清抗体增长不明显;第2次、第3次免疫后阴性对照PBS免疫组和G-H+pcDNA3.1免疫组的抗体水平没有明显变化,而G-H+pcDNA3.1-pBoIFN-γ免疫组、G-H+pr-mBoIFN-γ免疫组和G-H+pcDNA3.1-pBoIL-2免疫组的抗体水平显著高于阴性对照组却又显著低于灭活疫苗免疫组(P<0.05)。此外,G-H+pcDNA3.1-pBoIL-2、G-H+pcDNA3.1-pBoIFN-γ免疫组中和抗体滴度(neutralizing antibody titer, NAT)显著高于G-H+FA免疫组,表明与弗氏佐剂比较,细胞因子分子佐剂在免疫中会起到更为显著的效果。淋巴细胞增殖试验结果表明,首次免疫后35天,G-H+pcDNA3.1-pBoIFN-γ免疫组小鼠淋巴细胞显示出了最高的增殖水平,其次是G-H+pcDNA3.1-pBoIL-2免疫组和G-H+Pr-mBoIFN-γ免疫组,三者的淋巴细胞增殖水平均显著高于G-H+pcDNA3.1免疫组和PBS免疫组。细胞因子检测试验结果显示,所有免疫组中,灭活疫苗免疫组诱导了最高水平的IL-4,G-H+Pr-mBoIFN-γ免疫组诱导了最高水平的IFN-γ,这与抗体检测试验和淋巴细胞增殖试验检测结果是一致的。而与G-H+pcDNA3.1免疫组比较,G-H+pcDNA3.1-pBoIL-2、pcDNA3.1-pBoIFN-γ和G-H+pr-mBoIFN-γ免疫组无论是IL-4的相对表达水平还是IFN-γ的相对表达水平均有显著的提高,进一步说明rBoIL-2和rBoIFN-γ对G-H免疫小鼠产生的体液免疫和细胞免疫均具有增强作用。总之,本研究为Asia1型FMDV G-H环多肽在FMD免疫方面的研究和应用提供了理论依据和材料支持,也为细胞因子佐剂的进一步发展奠定了理论基础。