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近年来抗生素作为添加剂在饲料中得到广泛使用,在畜禽的防病和促生长的方面发挥着重要作用。但随之而来的是大量耐药菌株的产生、畜禽产品中药物残留等问题。实践和研究表明,益生菌是一种良好的抗生素替代品。地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis,B1)和粪肠球菌(Enterococcus faecalis,Ef)可抑制病原微生物的生长,并产生多种营养物质,因此B1和Ef可作为益生菌添加于饲料中。本研究利用益生菌分离筛选的常规方法,分别得到具有良好益生特性的地衣芽孢杆菌B1和粪肠球菌NA14,对其生物学特性、细菌素和应用试验进行研究,实验表明两株菌株对断奶仔猪有防病和促生长作用。1.猪源益生地衣芽抵杆菌与粪场球菌的分离、鉴定及生物特性分析从健康仔猪的肠道及粪便中分离得到3株芽孢杆菌和18株肠球菌。以肠道致病菌大肠杆菌0157、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌C78-1为抗菌试验的指示菌株,其中芽孢杆菌菌株B1和肠球菌菌株NA1、NA3、NA4、NA10、NA14和NA18对指示菌有显著地抑制作用。综合培养特性、生理生化试验和16SrRNA序列分析鉴定方法,结果表明分离到的菌株B1为地衣芽抱杆菌,菌株NA4和NA14为粪肠球菌。进一步对上述菌株进行生物学特性研究,菌株B1能够耐受人工胃液2h和人工肠液2.5h,在0.3%胆盐12h和90℃ 15min作用下该菌株的存活率接近100%。菌株NA4和NA14在人工胃液中2h,细菌数量下降一个数量级,而人工肠液处理无影响;NA14耐胆盐能力比NA4强,可耐受0.3%胆盐;两者均能耐受60℃温度。在菌株B1和菌株NA14的抗生素敏感试验中,发现菌株对常见的多种抗生素均敏感,仅对青霉素、金霉素和多粘菌素B表现出耐药性,可避免动物体内微生物之间抗生素抗性的转移。利用仔猪空肠上皮细胞(IPEC-J2)检测B1和NA14的粘附性,粘附率分别为0.88%和8.7%,实验结果表明粪肠球菌具有较好的粘附能力。2.菌株分泌抗菌物质的纯化和鉴定菌株B1和NA14发酵液表现出广谱抗菌能力,两种发酵液对所列指示菌都有抑制作用。采用硫酸按法对培养基上清中的抗菌物质进行纯化。B1细菌素具有良好的热稳定性和酸碱稳定性,100℃及以下处理30min抑菌活性未发生任何改变;在pH 6-9之间活性维持稳定;在常见的蛋白酶中仅对蛋白酶K敏感;超滤管处理细菌素大小在3000-5000Da之间。NA14细菌素最高耐受温度为50℃,最佳pH为6-7,仅对蛋白酶K敏感,分子量在5000-10000Da之间。PCR方法检测B1和NA14细菌素的存在,结果表明NA14细菌素为enterocin A。3.菌株B1和NA14的发酵工艺优化在发酵基础培养基的基础上,分别对菌株B1和NA14的发酵条件和成分进行优化。B1菌株的最优发酵条件为初始pH值为6.5,8%接种量,30℃ 190r/min,最佳培养基配方:葡萄糖5%、牛肉膏20g/L、CaCl2 10g/L、MgSO45g/L。NA14菌株发酵条件为初始pH值为7.0,6%接种量,37℃ 180r/min,最佳培养基配方:蔗糖1%、牛肉膏20g/L、CaCl21 g/L、MgSO4 1 g/L。4.益生菌的应用研究试验选取杜长大三元杂交断奶仔猪(30日龄)160头,随机分为4组,分别饲喂金霉素(75mg/kg)、金霉素+地衣芽孢杆菌(75mg/kg + 200亿CFU/g)、金霉素+粪肠球菌(75mg/kg + 200亿CFU/g)、金霉素+地衣芽孢杆菌和粪肠球菌复合制剂(75mg/kg+地衣芽孢杆菌:150亿CFU/g,粪肠球菌:50亿CFU/g),连续饲喂30d。结果显示,益生菌各组在提高日增重、降低料肉比和腹泻率方面均好于抗生素组,但差异不显著;地衣芽孢杆菌和粪肠球菌抑制肠道大肠杆菌的生长,也能促使机体免疫力产生;综合评价复合菌制剂比单一菌株作用能力强。