论文部分内容阅读
丛枝菌根(arbuscular mycorrhiza，AM)真菌是一类广泛存在于陆地生态系统并与大多数植物形成共生关系的土壤真菌。菌根共生体在植物适应重金属污染环境中的作用得到越来越多的关注。很多研究表明菌根共生体能够增强植物对砷(As)污染的耐受能力。在As污染环境中，AM真菌能够影响宿主植物对As的吸收和累积，并能够影响植物体内As的形态转化。然而，有关AM真菌吸收转化砷的生理和分子机制仍不清楚，也极少有研究关注AM真菌自身对于As的耐受性。此外，在逆境胁迫下，AM真菌生长发育受到抑制，AM真菌多样性降低，但在长期高砷污染环境中，有关AM真菌群落结构以及优势种属的研究亦少见报道。 本论文调查了湖南省雄黄矿地区长期高砷污染环境中AM真菌的多样性，探明了高砷污染环境中AM真菌的优势种属以及各采样点中的共有种属，分析了影响AM真菌群落结构的主要土壤环境因子。研究了根生囊霉属（Rhizophagus）AM真菌Rhizophagus irregularis DAOM197198对As的吸收及转化，从分子层面揭示了AM真菌耐受砷的机理。主要研究内容及结果归纳如下: (1)采用454-焦磷酸测序的方法调查研究了湖南省雄黄矿地区AM真菌的多样性。在雄黄矿地区长期砷污染的土壤中，AM真菌仍具有较高的多样性。共检测到11个属的AM真菌，在所有样点中都出现的属为球囊霉属（Glomus），根生囊霉属（Rhizophagus）以及近明囊霉属（Claroideoglomus）。其中，Glomus为优势属。冗余分析(RDA)表明，影响雄黄矿地区AM真菌群落结构的主要环境因子为土壤pH，其次是土壤镉(Cd)浓度和总砷(T-As)浓度。 (2)采用双重无菌培养体系研究了AM真菌根外菌丝对砷的吸收及转化。研究发现，AM真菌根外菌丝具有将As(Ⅴ)还原为As(Ⅲ)的能力，并且能够将As(Ⅲ)转化为二甲基砷(DMA)，在此过程中产生中间产物单甲基砷(MMA)。菌根室固体培养基中加入10 mg/kg Na3AsO4·12H2O处理，培养16周后，菌丝室液体培养基以及菌丝中均检测到了As(Ⅴ)、As(Ⅲ)及DMA，菌丝内的总砷浓度达到3009.9μg/kg。菌丝室中加入200μg/kg Na3AsO4·12H2O处理12h后，菌丝室中开始出现少量DMA，处理108 h后，菌丝室中DMA在总As中所占比例达到29.8％。菌丝灭活对照组以及无菌丝的对照组的液体培养基中始终只有As(Ⅴ)一种砷形态。在菌丝室中加入200μg/kg Na3AsO4·12H2O时，菌丝内砷形态的变化更为快速。处理1h后菌丝内即检测到了As(Ⅲ)与As(Ⅴ)两种形态，其浓度分别为:138.7μg/kg、156.4μg/kg。处理12h后，菌丝内共检测到了4种形态的砷:As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA、DMA，且菌丝中的总As浓度达到1813.9μg/kg。从48h开始菌丝内只有As(Ⅴ)一种形态。灭活后的菌丝体内自始至终均只有As(Ⅴ)一种形态，最大浓度为603.4μg/kg。这些结果表明:AM真菌菌丝具有砷的还原能力以及甲基化砷的能力;同时，AM真菌根外菌丝对砷具有较强吸附能力，即使已经灭活的菌丝，仍然能够吸附较多的砷。 (3)在AM真菌Rhizophagus irre gularis DAOM197198菌株中，克隆得到砷的还原酶基因（RirrarsC）以及砷的甲基转移酶基因(RirrarsM)。经过异源表达分析，RirrarsC、RirrarsM基因均具有相应的功能。砷还原缺陷型大肠杆菌WC3110在表达了RirrarsC基因后，对As(Ⅴ)的还原能力提高了33.7％。砷敏感型大肠杆菌AW3110在表达了RirrarsM基因后能够将As(Ⅲ)转化为DMA，中间产物为MMA。这一结果揭示了AM真菌耐受砷的分子机理。 本研究通过高通量测序技术探究了长期砷污染环境中AM真菌的多样性，了解了适应高砷污染环境的AM真菌种属以及影响AM真菌群落结构的环境因子。利用双重无菌体系证明了AM真菌菌丝具有砷的还原、甲基化能力，并通过分子克隆的手段获得了AM真菌菌丝中砷的还原酶及甲基转移酶相关功能基因，从生理和分子角度揭示了AM真菌耐受砷的机理，深化了对菌根共生体参与砷的迁移、转化等过程的认识，为利用菌根修复砷污染土壤提供了理论依据。