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目的制备适合应用于大段骨缺损动物实验的DS/rhBMP-2/CS缓释人造骨材料,保证骨生长过程既有rhBMP-2的骨诱导作用,又有支架骨的骨传导作用,保证动物实验的可行性,并验证其成骨化和血管化效应。方法1.采用离子交联法制备缓释纳米微球,称取CS粉末,并溶于0.175%的乙酸中,制备1mg/ml的壳聚糖溶液;用0.45μm和0.22μm滤膜依次过滤;称取适量DS溶于双蒸水,配成1mg/ml DS溶液,再用0.45μm和0.22 μm滤膜依次过滤;在无菌条件下,取2.08ml硫酸葡聚糖溶液在1500rpm转速下搅拌,加入100ug的人重组形态发生蛋白-2,持续搅拌20min后加入1.04ml的壳聚糖溶液,搅拌5min后加入0.1ml硫酸锌,持续搅拌30min;加入5%的甘露醇后持续搅拌均匀,制成葡聚糖/人重组形态发生蛋白-2/壳聚糖复合微球。将CHA(体积20*5*5 mm3)投入溶液中,充分浸泡后,转入-80℃超低温冰箱中预冻24h,把预先冷冻好的材料转移至预冷好的冷冻干燥机持续冻干24小时,制DS/rhBMP-2/CS/CHA人造骨(体积20*5*5mm3)骨修复材料,转移到-80℃超低温冰箱,备用。2.造模和植入:造模前,动物手术间经紫外线消毒,所有手术器械均经高温高压消毒。动物称重,记录体重,按1ml/kg麻醉标准,将3%戊巴比妥沿耳缘静脉缓慢推注麻醉。剔除兔右前肢毛发,侧卧位,上止血带,常规消毒,铺巾,在手术切口周围注射少量利多卡因行局部麻醉,于右前肢中段外侧做一长约3.0cm的纵行切口,钝性分离浅深筋膜,避开血管,暴露中段桡骨,生理盐水冲洗术区,直视下截取一长为20mm的桡骨(如图6,7,8),冲洗术区,逐层缝合至皮肤,去除止血带,加压包扎,将各组材料分别植入骨缺损区,术后连续肌注青霉素(8万单位/kg)3天预防感染,观察术口情况,术后7天拆线,分笼独立正常喂养。57只动物(雄性,24周龄,3.5kg)按随机分为 4 组,A 组:CHA,18 只,B 组:DS/rhBMP-2/CS/CHA(含100ug rhBMP-2),18 只,C 组:rhBMP-2/CHA(含 100ugrhBMP-2),18 只。另设 3 只作为空白组。实验周期:4周,8周,12周。结果综合大体标本、血清学、影像学和组织学四类实验结果,三组材料的成骨化及血管化情况均符合预期,且组织学情况符合影像学的表现。在第4、8、12周时,缓释微球人造骨组的成骨质量及新生血管数量最好,成骨最活跃,呈可持续发展,血清ALP及BGP水平的升检测亦符合该表现,与rhBMP-2/CHA组、单纯CHA组在统计学上有明显差异(p<0.05),表明微球对rhBMP-2的缓释作用,使其可以在各时期的持续释放并作用于骨缺损区,发生良好的成骨化和血管化效应。第4周时复合rhBMP-2组成骨速度及新生血管数量好于单纯CHA组,并可能稍好于缓释微球人造骨组,但在第8周和第12周,突释组的新生血管数量明显减少,且突释组与单纯CHA组的成骨表现基本相似,12周的大体标本可见两组的成骨质量均一般,两对照组血清学检查未见统计学差异(p>0.05),说明在骨形成早期,rhBMP-2的突释作用,其大量释放并作用于骨缺损区,故早期的成骨作用是非常强大的,而到了中后期,由于缺乏缓释载体系统,随着rhBMP-2含量的大量减少,后期的成骨作用乏力,无法促进组织的有效成骨。结论DS/rhBMP-2/CS复合微球联合CHA的人造骨材料具有明显的缓释rhBMP-2的作用,在大段骨却缺的修复上的成骨化与血管化表现良好,但运用于临床仍需要较长时间的探索,可为未来的骨组织工程中提供研究的思路与方法。