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第一部分:生理和病理情况下cTnⅠ的核移位现象目的:由TNNI3基因编码的心肌肌钙蛋白I(Cardiac troponin I,cTnⅠ)过去一直被认为是一种胞浆蛋白,但本课题组前期研究和文献报道肌钙蛋白(Troponin I,TnⅠ)可以进入细胞核。此部分实验旨在验证TnⅠ核移位现象的普遍性,及探讨生理和病理情况下核移位比值的改变。方法:1、以c57小鼠为研究对象,通过对其心脏组织的核浆蛋白分离,将心肌组织蛋白分离为核蛋白(Nu)、浆蛋白(Cy),利用WB检测核蛋白及浆蛋,白内cTnⅠ的表达;2、以11w、14w人胎儿为研究对象,通过对其心脏组织的核浆蛋白分离,将心肌组织蛋白分离为核蛋白、浆蛋白,利用WB检测核蛋白及浆蛋白内TnⅠ的表达;3、以c57小鼠原代心肌细胞为研究对象,通过免疫荧光技术检测cTnⅠ的入核现象及核移位比值;4、以SD大鼠为研究对象,分为左心室和右心室心脏组织,通过提取总蛋白和核浆蛋白分离,利用WB检测总蛋白与核蛋白内cTnⅠ的表达并统计核移位比值;5、以SD大鼠为研究对象,通过主动脉缩窄术(TAC)分为假手术组(Sham组)和以左心衰为主要病理改变的TAC术组,通过提取各组左心室心脏组织的总蛋白和核浆蛋白分离,利用WB检测总蛋白与核蛋白内cTnⅠ的表达并统计核移位比值;结果:1、c57小鼠心脏组织的核蛋白和浆蛋白中均能检测到cTnⅠ的表达;2、11w、14w人胚胎心脏组织中的核蛋白和浆蛋白中均能检测到TnⅠ的表达;3、原代心肌细胞中有30.43±1.073%的cTnⅠ存在于小鼠心肌细胞的细胞核中;4、大鼠的左心室心脏组织中cTnⅠ入核比值较右室显著增加(p<0.05);5、TAC术组大鼠左心室心脏组织cTnⅠ入核比值较Sham组显著降低(p<0.05)。结论:1、cTnⅠ/TnⅠ的入核现象普遍存在于小鼠、大鼠及人胎儿心脏组织中;2、生理情况下右心室较左心室cTnⅠ入核比的降低以及心衰情况下入核比的降低提示核内的cTnⅠ可能参与心肌舒缩功能的调控。第二部分:cTnⅠ调控ATP2a2/SERCA2a表达及其内在机制目的:前期对于TNNI3/cTnⅠ协同共表达生信分析结果表明TNNI3 与编码肌浆网 Ca2+-ATP 酶 2a 亚型(Sarcoplasmic reticulum Ca2+ATPaseisoform2a,SERCA2a)的 ATP2a2 基因具有较强的表达一致性。此部分实验旨在研究cTnⅠ对ATP2a2/SERCA2a的调控,并进一步探讨其调控机制。方法:1、以c57小鼠为研究对象,通过尾静脉注射空载腺病毒和TNNI3基因重组腺病毒,将小鼠分为对照组和过表达组;通过TNNI3基因敲除杂合子与野生型小鼠杂交产生cTnⅠ+/-小鼠和同窝cTnⅠ+/+小鼠,利用 Q-PCR 和WB 分别检测心脏组织内TNNI3/cTnⅠ、ATP2a2/SERCA2a的转录和蛋白表达水平;2、以c57小鼠原代心肌细胞为研究对象,通过转染空载腺病毒和TNNI3基因重组腺病毒,将细胞分为对照组和过表达组;通过转染siRNA-TNNI3将细胞分为对照组和敲低表达组,利用Q-PCR和WB分别检测心脏组织内TNNI3/cTnⅠ、ATP2a2/SERCA2a的转录和蛋白表达水平;3、以c57小鼠原代心肌细胞为研究对象,通过转染siRNA-TNNI3将细胞分为对照组和敲低表达组,通过光学显微镜下记录并统计细胞搏动频率;通过荧光光度计检测细胞内AP含量;利用钙离子探针,观察细胞内钙震荡频率和幅度改变,检测经SERCA特异性抑制剂毒胡萝卜素(Thapsigargin,TG)处理后内质网释放钙离子量;4以c57小鼠心脏组织为研究对象,利用ChIP-seq技术,检测cTnⅠ蛋白与ATP2a2启动子区域的结合水平,预测cTnⅠ特异结合的DNA序列;并利用ChIP-QPCR对ATP2a2启动子区域各段的结合水平进行验证;5、在293A细胞中,共转染pcDNA3.1质粒/TNNI3过表达质粒与ATP2a2启动子荧光素酶报告基因质粒,将细胞分为对照组和过表达组,通过荧光分光光度计检测cTnⅠ对ATP2a2转录活性的影响;结果:1、过表达组小鼠心脏组织中ATP2a2转录和蛋白水平较对照组显著上调(p<0.05;p<0.05);cTnⅠ+/-小鼠心脏组织内ATP2a2转录和蛋白水平较cTnⅠ+/+小鼠显著降低(p<0.01;p<0.01);2、过表达组原代心肌细胞中ATP2a2转录和蛋白水平较对照组被上调(p<0.05;p<0.05);siRNA-TNNI3组原代心肌细胞中ATP2a2转录和蛋白水平较对照组被下调(p<0.05;p<0.01);3、siRNA-TNNI3组原代心肌细胞在转染后24h、48h时搏动频率较对照组明显降低(p<0.0001;p<0.0001);siRNA-TNNI3组细胞内ATP总量增加(p<0.05);siRNA-TNNI3组较对照组细胞内钙瞬变频率明显降低,经TG处理后,细胞内钙离子浓度上升幅度较对照组减少。4、cTnⅠ可结合DNA序列在ATP2a2启动子-239～-889区域高富集;软件分析cTnⅠ的特异结合序列motif为“CCAT”;5、转染TNNI3质粒过表达组与对照组比较荧光素酶的活性显著增加(p<0.0001)。结论:1、在体内和体外,cTnⅠ均能调控ATP2a2/SERCA2a的表达;2、cTnⅠ可能通过调控ATP2a2/SERCA2a的表达影响细胞内钙离子稳态,进而调节心肌细胞的舒缩功能;3、cTnⅠ对ATP2a2/SERCA2a的调控机制是通过核内的cTnⅠ结合在ATP2a2启动子区域,影响ATP2a2的转录活性。