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白桦外皮中含有丰富的三萜类产物,具有多种药理活性,其中白桦脂酸、白桦脂醇类代谢产物拥有抗肿瘤、抗艾滋病的功效。自然情况下,白桦外皮中三萜含量低,而体外合成成本高,因此,利用基因工程技术探索三萜合成与生产的方法尤为重要。转录因子以其“多点调控”的方式可以从整体角度对代谢途径进行调控,进而提高植物中目标代谢产物的含量。本实验以白桦（BetulaPlatyphllasuk.）为实验材料,结合实验室前期筛选的响应MeJA和SA信号的bHLH转录因子基因,拟克隆与白桦三萜合成相关的BpbHLH7和BpbHLH8基因全长及其启动子序列,并进行生物信息学分析;研究了BpbHLH7和BpbHLH8基因时空及非生物胁迫表达模式;同时分别构建了BpbHLH7和BpbHLH8的酵母表达载体及BpbHLH8的植物过表达和干扰载体,对其在白桦和酵母中的表达特性和基因功能进行研究。以期明确BpbHLH7和BpbHLH8转录因子在白桦生长发育及三萜合成调控中的功能,为白桦三萜类物质代谢工程研究提供理论依据和技术支持。本研究结果如下:1.以白桦组培苗RNA反转录的cDNA为模板,应用特异性引物结合RT-PCR技术,克隆得到白桦BpbHLH7和BpbHLH8基因的cDNA全长,生物信息学分析表明,BpbHLH7基因的ORF全长为618 bp,编码205个氨基酸;BpbHLH8基因的ORF全长为1203 bp,编码400个氨基酸。两个基因编码的蛋白质均具有螺旋-环-螺旋DNA结合保守结构域,其附近存在E-box和N-box位点,并具有α螺旋、延伸链和无规则卷曲,为不稳定蛋白,具亲水性,同时两个蛋白分别与胡桃（Juglans regia）bHLH家族蛋白（XP018831783.1和XP018851563.1）相似度最高,分别达67%和77%。系统进化树表明,白桦BpbHLH7和BpbHLH8编码的氨基酸序列分别同胡桃的bHLH转录因子进化树属于同一个分支,本研究获得的白桦BpbHLH7和BpbHLH8基因可能是bHLH家族中的新成员。2.利用实时定量PCR技术,对BpbHLH7和BpbHLH8基因的时空表达特性和非生物胁迫表达模式进行分析。结果表明,在六月中旬至九月中旬期间,三年树龄的白桦植株中,BpbHLH7基因表达量呈现先降低再回升最后骤降的趋势,且在八月中旬,该基因表达量最高。而BpbHLH8基因表达量呈现先升高后骤降的趋势,其表达量在七月中旬达到最高值。BpbHLH7和BpbHLH8基因分别在组培苗的茎和叶中表达量较高,二者在根中的表达均较低。组培苗中BpbHLH7和BpbHLH8两个基因对不同非生物胁迫的响应不同。对于BpbHLH7,乙烯处理诱导48 h效果相比于其他处理作用最为显著,各种胁迫对于BpbHLH7诱导使其表达量达最高的时间也不同。BpbHLH8经ABA、JA、SA、GAs和叶伤处理后,均在12 h处达到最高表达量,乙烯处理后,其表达量于48 h达最高。3.利用染色体步移技术克隆获得BpbHLH7和BpbHLH8基因的启动子序列,其片段长度分别为919 bp和1285 bp,使用PlantCARE数据库对其进行序列分析,发现BpbHLH7和BpbHLH8启动子中含有TATA-box和CAAT-box等多种在其他植物启动子中也普遍存在的顺式作用元件。也得到多个植物激素响应元件如脱落酸响应元件、茉莉酸响应元件,另外存在多种胁迫响应元件,同时BpbHLH7启动子中存在水杨酸响应元件,BpbHLH8启动子中存在赤霉素响应元件和一个能与MYB转录因子结合的MBS顺式作用元件。此外,BpbHLH7和BpbHLH8启动子均有活性。4.利用pYES3质粒分别构建BpbHLH7和BpbHLH8的酵母表达载体,转化INVScl及实验室之获得的INVScl-pYES2-SS和INVScl-pYES2-SE,获得重组酵母细胞,并对细胞中的角鲨烯和总三萜含量及鲨烯环氧酶活性进行了检测。结果发现,与其他重组酵母相比,当同时转入SE和BpbHLH8时,总三萜含量和鲨烯环氧酶活性相比于对照提升效果最为显著,分别为对照酵母的1.15倍和2.76倍;同时转入SS和BpbHLH8时,角鲨烯含量提升效果最为显著,可达对照的11.02倍。这些结果表明BpbHLH7和BpbHLH8基因确实参与角鲨烯和三萜类化合物的合成。5.成功构建了BpbHLH8基因过表达和干扰载体pCAMBIA1303-BpbHLH8和pRNAi-GG-BpbHLH8,利用三亲杂交法将获得的载体转移至根癌农杆菌LBA4404中,通过农杆菌瞬时侵染实现pCAMBIA1303-BpbHLH8和pRNAi-GG-BpbHLH8白桦植株中的瞬时表达。研究发现三萜途径关键酶基因（SS、SE、DS、BPW、HMGR、BPX2）的相对表达量均表现出不同程度的上调,其中其中SE基因表达上调的最为显著,其表达于48 h达峰值,为对照的11.26倍;总三萜含量分析结果显示,白桦三萜含量升高,并于24 h达最高,为对照的1.25倍。pRNAi-GG-BpbHLH8农杆菌处理后BpbHLH8和三萜途径关键酶基因（SS、SE、DS、BPW、HMGR、BPX2）的相对表达量出现不同程度的降低,其中以SS基因最为显著,72 h时其表达量仅为对照的34%。