研究背景和目的胆管癌是一类发生于胆道树内不同位置的上皮细胞恶性肿瘤。过去三十年中,全球胆管癌的发病率和死亡率不断增加。胆管癌早期缺乏典型症状,诊断时多为疾病晚期,一线化疗方案的客观反应率有限,胆管癌患者5年生存率低,预后较差。因此,亟需研发改善预后的药物。提高现有治疗药物的有效率,扩大敏感人群范围,比从头研发新药的时间和经济成本更低,同时安全性更好。本课题组参与的一项Ⅱ期临床试验,研究蛋白酶体抑制剂硼替佐米在人第10号染色体缺失的磷酸酶与张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog,PTEN）表达缺失的、一线化疗失败且疾病进展的晚期胆管癌患者中的疗效,回顾性评估发现,PTEN表达缺失的晚期胆管癌患者对一线GEMOX（吉西他滨加奥沙利铂）化疗方案较PTEN阳性表达的胆管癌患者更为敏感。基于上述结果,我们将研究PTEN差异表达对胆管癌一线化疗药物吉西他滨和奥沙利铂敏感性的调控机制。通过使用胆管癌临床样本、胆管癌细胞系和小鼠的患者来源的肿瘤异种移植物（PDX）和皮下荷瘤模型进行验证,并结合分子生物学实验和动物实验技术,探索PTEN阳性和阴性表达影响一线化疗药物敏感性的具体机制,为胆管癌的分群治疗提供实验依据。研究方法1、收集临床新鲜的胆管癌手术切除或穿刺样本,通过免疫组化检测PTEN表达,回顾性分析PTEN阳性和阴性表达的患者经一线化疗后的疗效和生存差异,以及仅经手术治疗的生存差异。2、通过免疫印迹、药敏实验和流式检测验证PTEN阳性和阴性表达的胆管癌细胞系对吉西他滨和奥沙利铂的敏感性。3、应用重组质粒转染、siRNA转染、shRNA慢病毒和Cas9-sgRNA慢病毒感染建立PTEN差异表达的胆管癌细胞系,包括PTEN敲低、PTEN敲除和PTEN过表达;分离培养PTEN条件性敲除小鼠的胚胎成纤维细胞,利用Cre或PTEN重组腺病毒构建PTEN敲除或过表达的细胞。通过免疫印迹、免疫荧光、细胞活力试验、免疫组化验证在细胞水平的PTEN差异表达对吉西他滨和奥沙利铂药物敏感性的影响。4、建立差异表达PTEN细胞来源的小鼠皮下荷瘤模型、PTEN阳性和阴性表达的PDX小鼠模型,体内实验评估PTEN差异表达对吉西他滨药物敏感性的影响。5、通过定量质谱检测差异表达PTEN的胆管癌细胞系中脱氧胞苷（dC）、吉西他滨和磷酸化吉西他滨的含量。通过RNA-seq、免疫印迹和双荧光素酶报告基因实验,检测差异表达PTEN的胆管癌细胞系中与吉西他滨转运、活化和嘧啶合成相关的基因的mRNA、蛋白表达水平,以及启动子的转录活性。6、通过质粒、siRNA转染,经免疫印迹、药敏实验和流式分析检测在胆管癌细胞中过表达和敲低脱氧胞苷激酶（deoxycytidinekinase,DCK）对吉西他滨诱导的DNA损伤和细胞周期阻滞的影响,并评估DCK是否参与了 PTEN对吉西他滨药物敏感性的调控。7、制备并筛选DCKSer74（以下简称S74）位点磷酸化抗体,通过免疫印迹和免疫组化在细胞和动物水平,检测PTEN差异表达对DCK S74位点磷酸化的影响。8、通过免疫组化检测临床胆管癌样品中磷酸化DCK S74的表达,统计分析DCK S74磷酸化表达与化疗疗效或PTEN表达之间的关系。9、通过免疫印迹检测AKT抑制剂和mTOR抑制剂,以及PTEN不同突变体对DCK磷酸化的表达影响。10、通过免疫共沉淀和表面等离子共振检测PTEN与DCK蛋白的结合情况;真核表达纯化PTEN和DCK蛋白,构建体外去磷酸化反应,并通过免疫印迹检测PTEN对DCK的去磷酸化情况。11、通过免疫共沉淀联合质谱检测,鉴定与PTEN、DCK相互结合的蛋白,重点关注与他们结合的蛋白磷酸酶;真核表达纯化PTEN、DCK、磷酸甘油酸变位酶5（phosphoglycerate mutase family member 5,PGAM5）、PP1 和 PP2A 蛋白,构建体外去磷酸化反应,通过孔雀石绿反应和免疫印迹验证结合蛋白对DCK的去磷酸化效果。12、通过免疫印迹、流式分析和药敏实验验证在胆管癌细胞系中过表达和敲低PP2Ac对DCK磷酸化以及吉西他滨药物敏感性的影响,并评估PP2Ac是否参与PTEN对DCK磷酸化以及吉西他滨药物敏感性的影响;通过小鼠胆管癌细胞系皮下荷瘤模型评估PP2A抑制剂LB100对吉西他滨药物敏感性的影响。13、通过免疫印迹检测PTEN表达缺失对C端和N端带Flag标签的PP2Ac（分别是CF-PP2Ac和NF-PP2Ac）酶活性的影响,构建体外去磷酸化反应,检测PTEN对CF-PP2Ac和NF-PP2Ac蛋白的去磷酸化效应。14、通过免疫印迹、酶活性实验和去磷酸化反应验证PTEN差异表达及不同酶活性突变体对PP2Ac磷酸化和酶活性的影响。15、通过免疫共沉淀、GST-pull down及表面等离子共振验证PP2Ac、PTEN和DCK的结合情况。16、在肿瘤药物敏感性基因组学（Genomics of Drug Sensitivity in Cancer,GDSC）和癌症细胞系百科全书（Cancer Cell Line Encyclopedia,CCLE）数据库中分析PTEN和DCK表达在肿瘤细胞系中对吉西他滨药物敏感性的影响。17、验证PTEN表达缺失促进吉西他滨药物敏感性的泛肿瘤普适性,并在临床新鲜收集的胰腺癌样品、胰腺癌细胞和宫颈癌细胞中进行验证。研究结果1、共收集98例接受以吉西他滨为基础的一线化疗的晚期胆管癌样品,其中PTEN表达缺失的30例,在PTEN表达阴性的胆管癌患者中一线化疗方案的疗效更为显著。尽管在生存期上无明显差异,但在一线化疗治疗早期（前6个月）PTEN阴性表达组的无进展生存期（progression-free survival,PFS）和总生存期（overall survival,OS）显著优于PTEN阳性表达组。共收集127例仅接受手术治疗的队列,其中PTEN阴性表达组的无病生存期（disease-free survival,DFS）和OS显著低于PTEN阳性表达组。2、RBE、TFK1和CC143476是PTEN阳性表达胆管癌细胞系,而HCCC-9810和SK-CHA-1是PTEN表达缺失胆管癌细胞系。相较于PTEN阳性表达的细胞,PTEN表达缺失的细胞HCCC-9810和SK-CHA-1对吉西他滨的反应更为敏感,但两组细胞对奥沙利铂的反应性没有显著差异。胆管癌细胞中PTEN表达缺失促进吉西他滨的药物敏感性,而不影响奥沙利铂的敏感性。3、胆管癌细胞中PTEN表达缺失促进吉西他滨诱导的细胞周期阻滞、细胞凋亡,以及吉西他滨联合奥沙利铂的药物敏感性。4、小鼠皮下荷瘤模型中PTEN表达缺失促进吉西他滨的药物敏感性;同样,PTEN表达缺失的胆管癌PDX肿瘤对吉西他滨的治疗更敏感。5、在胆管癌细胞中差异表达PTEN,不影响细胞内脱氧胞苷和吉西他滨的含量,但显著影响吉西他滨的磷酸化激活;PTEN差异表达不影响吉西他滨的摄取和脱氧胞苷的生物合成。6、在胆管癌细胞中,DCK促进吉西他滨诱导的DNA损伤和细胞周期阻滞。7、制备与筛选后得到的DCK S74位点磷酸化抗体特异性好,抗体效价高。胆管癌中PTEN表达缺失促进DCK S74位点的磷酸化。8、胆管癌患者中p-DCK S74高表达预示吉西他滨药物反应性较好;PTEN与p-DCK S74表达呈现严格的负相关。9、PTEN对DCK磷酸化的调控不依赖PI3K/AKT/mTOR通路。10、PTEN可以与DCK结合,但不能去磷酸化DCK。11、PP2Ac可以与DCK结合,并能去磷酸化DCK。12、敲低PP2Ac促进对DCK的磷酸化和吉西他滨的药物敏感性。PP2Ac参与PTEN对DCK的调控。PP2Ac抑制剂促进吉西他滨的药物敏感性。13、PTEN在Y307位点对PP2Ac去磷酸化,促进PP2Ac的活性。14、PTEN去磷酸化PP2Ac依赖自身蛋白磷酸酶活性。15、PTEN、DCK、PP2Ac三者相互结合形成复合物。16、数据库中,PTEN突变及DCK的mRNA高表达与吉西他滨在肿瘤细胞中的高敏感性呈正相关。17、以吉西他滨为基础的一线化疗在PTEN表达缺失的胰腺癌患者中治疗效果良好;胰腺癌细胞中干扰PTEN表达促进吉西他滨的药物敏感性;同时,宫颈癌HeLa细胞中敲除PTEN促进吉西他滨的药物敏感性。结论我们回顾性分析了一项Ⅱ期临床试验（NCT03345303）的疗效评估,发现PTEN表达缺失的晚期胆管癌患者对一线吉西他滨联合奥沙利铂的化疗方案较PTEN阳性表达的胆管癌患者更为敏感。基于上述现象,我们研究发现胆管癌中PTEN表达缺失使PP2Ac磷酸化增加,导致PP2Ac酶活性下降,从而促进DCK磷酸化和吉西他滨的药物敏感性。通过对GDSC和CCLE数据库的分析,我们发现PTEN表达缺失在多种肿瘤中促进吉西他滨的药物敏感性,提示我们的发现具有泛肿瘤的普适性。