游离小孢子培养(Isolated Microspore Culture, IMC)技术可以加快育种进程,特别是对于不结球白菜和青花菜等异花授粉作物。在短时间内可获得大量单倍体或纯合二倍体,在作物遗传育种、遗传分析、遗传图谱的构建和分子标记等方面具有重要的作用。本实验对不结球白菜和青花菜游离小孢子培养技术进行了研究,探明影响其胚胎发生及植株再生的主要因素,优化不结球白菜和青花菜游离小孢子培养技术体系,这将对于加快不结球白菜和青花菜等芸薹属蔬菜作物育种效率及促进其遗传分析等方面具有重要的意义。主要研究结果如下：以20个基因型的不结球白菜和10个基因型的青花菜为材料,确定了小孢子发育时期与花蕾长度的关系,研究了基因型对不结球白菜和青花菜游离小孢子培养胚胎发生的影响。研究发现同一花蕾中小孢子核的发育存在着不同步性,但小孢子发育时期与花蕾长度存在着一定的对应关系。一般而言,不结球白菜一般选择2～3mm长的花蕾,青花菜一般选择3～4mm长的花蕾进行游离小孢子培养；在20个不结球白菜供体基因型中有13个材料诱导出胚,占总不结球白菜供试材料的65%,其中最高出胚率达12.17胚/蕾；10个青花菜供体基因型中有4个材料诱导出胚,占总青花菜供试材料的40%,其中最高出胚率为4.30胚/蕾；因此,不同基因型的不结球白菜和青花菜游离小孢子培养胚状体诱导率存在差异。以基因型‘LBC-80’、‘LBC-82’和‘LBC-83’为材料,研究了小孢子培养密度、活性炭浓度和温度胁迫处理对游离小孢子培养胚胎发生的影响。当小孢子培养密度为每毫升1-2个蕾时,胚胎发生率较高；添加0.50 mg/mL的活性碳最有利于小孢子培养胚胎发生；热激处理是诱导游离小孢子培养胚胎发生的必要条件,花蕾低温预处理并非胚胎发生的必要条件；花蕾低温预处理和小孢子热激处理共同使用效果更好,胚胎发生率显著提高。以出胚率较高的基因型‘LBC-82’和‘A47-4’为材料,利用DAPI荧光染色液对培养中的小孢子每隔一天进行荧光染色,在荧光显微镜下观察了其胚胎发育过程。结果发现,按照小孢子胚胎发育第一次分裂方式划分,不结球白菜和青花菜游离小孢子培养胚胎发育过程中A、B途径都同时存在。热激培养1d后,多数存活的小孢子体积增大,有些小孢子细胞开始发生对称性或者不对称性分裂,第4d发生分裂的细胞数增多；随着小孢子的进一步分裂发育,会相继出现四细胞原胚、多细胞团、球型胚、心型胚、鱼雷型胚和子叶型胚的结构；约从18天开始,在培养皿中就会出现大量的肉眼可见的胚状体。以基因型’LBC-549’、’A36-5’、’A47-4’和‘A48-3’的胚状体为供试材料,探究了胚龄、琼脂浓度和添加椰汁对小孢子胚胎植株再生的影响。研究发现,在NLN液体培养基中胚龄为20～29天的胚状体转入到B5固体培养基中发育较快,再生率较高；含1%琼脂的B5固体培养基比含0.78%琼脂的B5固体培养基更有利于小孢子胚的进一步诱导,且有利于植株再生；培养基中加入10%的椰汁,能够促进不结球白菜和青花菜游离小孢子培养再生植株的生长,使其健壮、整齐,茎粗壮,根系发达,并能有效改善再生植株组培苗的玻璃化和脱叶现象。采用流式细胞仪鉴定倍性的方法鉴定了所得再生植株的倍性。其中不结球白菜自然加倍率达100%,青花菜基因型‘A36-5’和‘A47-4’自然加倍率也很高,都在90%以上,而基因型‘A48-3’很低,仅有9.09%。