甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因转化美丽胡枝子的研究

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美丽胡枝子(Lespedeza formosa)是优良的水土保持和饲料型豆科灌木,提高美丽胡枝子的抗盐性,扩大其栽培区域是开发利用盐渍地的有效途径,具有重要的生产意义。本论文通过对美丽胡枝子子叶节再生条件、选择剂筛选条件和遗传转化条件等众多因素的优化,建立了美丽胡枝子高频再生系统和遗传转化体系,并将BADH基因导入到美丽胡枝子中,获得了耐盐性增强的转基因植株。主要研究内容及结果如下:1.利用L16(45)和L9(34)正交设计,研究了6-BA、2,4-D、NAA、IBA、蔗糖和苗龄等因素对美丽胡枝子子叶节再生、节段扩繁和试管苗生根的影响,建立了子叶节外植体高效再生体系。通过试验确定了美丽胡枝子子叶节再生的最佳培养基为MS+0.5mg.L-16-BA+1.0mg.L-12,4-D+0.5mg.L-1NAA;试管苗增殖的最佳培养基为:MS+ 1.0mg.L-16-BA + 0.05mg.L-1NAA ;最佳生根培养基为1/2MS+0.4mg.L-1IBA +0.2mg.L-1NAA+30g.L-1蔗糖;不同苗龄的子叶节再生能力差别不大。2.采用PCR的方法,分别从pMD18-T载体上和pBI121-bar中克隆目的基因BADH和带有标记基因bar的35S-bar-nos片断,将它们插入到pBI121中,构建了植物表达载体pBIBADHbar,并将其分别转化了根癌农杆菌LBA4404、EHA105和C58。3.通过浓度梯度试验,研究了头孢霉素(Cef)和羧苄青霉素(Carb)两种脱菌剂对三种农杆菌的抑菌效果,发现Carb的抑菌效果较差,Cef浓度在200~300mg.L-1之间能有效控制LBA4404和EHA105的生长,而对C58的抑制效果稍差。在此基础上进一步研究了美丽胡枝子对Cef和选择剂草丁膦(Glu)的敏感性,确定了Cef浓度≤300mg.L-1为可耐受浓度;Glu1.0mg.L-1为子叶节再生的临界浓度,Glu0.3mg.L-1为试管苗生长和增殖的临界浓度,Glu0.2mg.L-1为试管苗生根的临界浓度。4.通过L9(34)正交试验和时间、浓度梯度试验,对影响农杆菌转化效率的主要因素进行了研究。试验结果表明,LBA4404是侵染美丽胡枝子子叶节效果最佳的根癌农杆菌类型,菌液浓度以OD600=0.6~0.8较为合适;子叶节在农杆菌侵染前预培养1d,侵染时间为20~30min,感染后共培养3d可获得较好的转化效果,在共培养基中附加100umol.L-1的AS、延迟4d选择和选择压由低到高进行梯度选择均可使转化率明显提高,转化率最高可达28%。
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