论文部分内容阅读
目的:本研究的主要目的是为了探索澳洲茄碱-中药龙葵中的有效成分之一抑制肝癌细胞增殖的可能分子机制,探索澳洲茄碱治疗肝癌可能的药物作用靶点及相关分子信号通路。希望为中药龙葵抗肿瘤作用的临床应用提供更确切及充分的理论依据。方法:体外实验部分:我们首先通过MTT法和EdU染色法验证澳洲茄碱对肝癌细胞增殖的抑制作用并确定相应的有效的药物剂量范围。然后我们采用Western Blot及Real-time PCR法筛选出与澳洲茄碱抑制肝癌细胞增殖的相关蛋白(SP1-转录因子特异性蛋白1、IRF5-干扰素调节因子5)和RNA(miR-375-3p,LncRNA CCAT1-结肠癌相关转录因子1)。最后,我们采用RNA干扰技术和过表达技术方法分别外源性的过表达SP1、IRF5、miR-375-3p和CCAT1,检测其过表达对相关蛋白及RNA表达的影响进而确定相关蛋白及RNA之间的相互调控关系。在这些实验方法之外,我们还选用了双荧光素酶报告基因法检测了澳洲茄碱对IRF5启动子活性的影响,SP1与IRF5启动子区域的相互结合作用以及miR-375-3p和CCAT1之间的相互结合。使用了 RNA结合蛋白免疫沉淀技术进一步确认miR-375-3p和CCAT1之间的相互结合。体内实验部分:我们首先使用了 HepG2-luc细胞(带有荧光素酶报告基因)来构建体内实验用的体表荷瘤小鼠模型。用不同剂量的澳洲茄碱来处理三组体表荷瘤小鼠。然后,我们使用小动物活体成像仪检测不同组小鼠给药前后荷瘤荧光值的变化,定期测量小鼠体表肿物的尺寸,处死后剥离小鼠体表的肿瘤并称量以不断观测澳洲茄碱处理对小鼠肿瘤生长的影响。最后,我们使用Western Blot法和Real-time PCR法对小鼠体表肿瘤中相应的蛋白和RNA表达进行检测,以验证体内实验的结果是否与体外实验结果一致。结果:体外实验部分:1.MTT结果提示,澳洲茄碱可以抑制HepG2肝癌细胞及QGY-7703细胞的增殖,作用方式为时间剂量依赖性的。EdU染色法也证实澳洲茄碱可以抑制肝癌细胞的增殖。2.Real-time PCR法检测发现澳洲茄碱在45μ M的时候可以促进miR-375-3p的表达,并且抑制CCAT1的表达,差异有统计学意义。CCAT1的表达可以被外源性过表达的miR-375-3p抑制,而外源性的过表达CCAT1又能抑制miR-375-3p的表达即miR-375-3p或CCAT1的表达会受到另一方表达的影响,两者之间存在相互调节的关系。3.miR-375-3p mimics与CCAT1 3’-UTR的双荧光素酶标记实验检测结果显示,CCAT1 3’-UTR WT+mimics 组与 CCAT1 3’-UTR MUT+mimics 组、CCAT1 3’-UTR MUT+NC组、CCAT1 3’-UTR WT+NC组比较有明显差异。转染CCAT1 3’-UTR WT质粒组的荧光素酶活性可以被过表达的miR-375-3p明显抑制。此结果说明CCAT1和miR-375-3p可能存在相互结合。RIP实验中,相对于IgG阴性对照组,Ago2抗体组的CCAT1和miR-375-3p的表达量均显著增加,差异有统计学意义。此实验结果进一步证实了 CCAT1和miR-375-3p之间有相互结合关系。4.在HepG2和QGY-7703细胞内,外源性的增加CCAT1或者抑制miR-375-3p的表达都会促进细胞的增殖。5.澳洲茄碱可以显著的抑制SP1的表达,且抑制作用随澳洲茄碱剂量的增加而增强。在HepG2细胞株和QGY-7703细胞株中进行的实验均提示,在澳洲茄碱浓度为30、40、50μ M的时候SP1的表达有显著的降低。而外源性的增加CCAT1的表达可以上调SP1的表达,外源性的增加miR-375-3p的表达可以下调SP1的表达。说明在HepG2和QGY-7703细胞内,CCAT1和miR-375-3p可以共同调节SP1的表达。外源性的促进SP1的表达可以逆转澳洲茄碱对CCAT1表达的下调,逆转澳洲茄碱对miR-375-3p表达的促进作用,SP1作为CCAT1和miR-375-3p的下游,对二者的表达起反馈调节作用。6.Western Blot检测发现澳洲茄碱可以抑制IRF5蛋白的表达,且抑制作用随澳洲茄碱剂量的增加而增强。澳洲茄碱浓度为40、50μ M的时候HepG2细胞中IRF5的表达有显著的降低,澳洲茄碱浓度为30、40、50μ M的时候QGY-7703细胞中IRF5的表达有显著的降低,与空白组比较差异有统计学意义。澳洲茄碱不仅可以下调IRF5蛋白的表达,而且可以降低IRF5启动子的活性。相对于对照组,澳洲茄碱处理组IRF5启动子活性明显下降,且差异具有统计学意义。7.外源性的过表达SP1可以逆转澳洲茄碱对IRF5蛋白及启动子活性的下调作用。验证了 SP1在IRF5启动子区域的结合。SP1通过与IRF5启动子区域结合从而调控IRF5蛋白的表达。8.外源性的过表达IRF5可以逆转澳洲茄碱对CCAT1的抑制作用及对miR-375-3p表达的促进作用,同时促进肝癌细胞的增殖。IRF5对CCAT1和miR-375-3p均有反馈调节作用。体内动物实验部分:体内动物实验结果也显示,澳洲茄碱可以抑制肝癌细胞的增殖,降低CCAT1及SP1、IRF5蛋白的表达,促进miR-375-3p的表达。结论:澳洲茄碱可以通过激活miR-375-3p和抑制CCAT1及SP1、IRF5蛋白的表达来抑制肝癌细胞的增殖。在澳洲茄碱的作用下,miR-375-3p和CCAT1之间可以相互调节,并共同调控下游SP1蛋白的表达。SP1蛋白的表达被抑制后,又最终抑制IRF5蛋白的表达。体外实验也证实了澳洲茄碱是通过与细胞实验一致的RNA和蛋白起作用的。本次研究部分揭示了澳洲茄碱抑制肝癌细胞增殖的新机制。