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鸭短喙侏儒综合征（Short beak and dwarfism syndrome,SBDS）是由新型鹅细小病毒（Novel goose parvovirus,N-GPV）引起的一种传染性疾病。2014年以来,SBDS在我国山东、河南、安徽和江苏等主要鸭养殖区暴发,造成了严重的经济损失。该病的典型症状为短喙、舌外伸和生长发育障碍,发病率通常为80%～100%,死亡率为10%～20%。骨骼作为重要的组织器官,在钙磷储存、免疫等方面发挥重要作用。骨代谢的平衡是保障鸭生长发育和生产的必要前提,由负责骨形成的成骨细胞和骨吸收的破骨细胞的共同维持。此前的研究报道显示,N-GPV感染严重抑制骨骼发育,但其抑制骨骼发育的机理尚不明确,因此本研究在病原学基础上,开展了N-GPV抑制鸭骨骼发育的分子机制研究。本研究借助代谢组测序技术（LC-MS）和转录组测序技术（RNA-Seq）,筛选骨骼发育相关的差异表达代谢物和基因,确定关键候选代谢物和基因,利用荧光探针检测、间接免疫荧光等分子生物学技术,探究N-GPV感染影响鸭骨骼发育的相关机制,并确定N-GPV抑制间充质干细胞（BMSC）的分子机制,为鸭短喙侏儒综合症的预防与治疗提供理论依据。研究内容主要分为以下四个方面:1.N-GPV遗传进化特征及致病性研究本研究分离鉴定出4株N-GPV分离株（AHDS、NMG21、SDLY、SDWF株）,序列分析结果显示,分离株与参考毒株之间的核苷酸同源性为91.8%～100%。分离株NS1和VP1蛋白区域分别鉴定出13和19个氨基酸变异位点,可能对病毒核酸的复制和致病性产生影响。遗传进化分析显示,AHDS分离株与其他三株分离株遗传演化关系较远,与JS1株、QH15株等参考毒株归于一个分支,分离毒株NGM21株、SDLY株、SDWF株之间彼此相似,与HN1P株、SD0402株等参考毒株处于同一分支,这提示与经典GPV毒株相比,N-GPV毒株已发生明显进化,形成独立的遗传进化分支。使用NGM21毒株分别感染1日龄雏鸭和雏鹅,通过病理学、组织病理学及器官病毒载量等检测,进行N-GPV的致病性研究。雏鸭感染NGM21株后出现死亡、生长发育受阻,表现出典型的SBDS症状。感染鸭肠道黏膜出血,绒毛坏死、脱落;肝脏出血,并伴有坏死;胆囊膨大,内胆汁充盈。病毒载量结果显示,病毒可迅速进入血液循环,入侵肝脏、脾脏、肺脏、胰腺、肠道等全身各组织器官,并在其中复制。此外,雏鹅的致病性研究结果表明,N-GPV感染能够引起感染鹅肝脏肿大、出血;胆囊膨大,胆汁充盈;肠道粘膜脱落、肠壁变薄等。以上结果表明,N-GPV的进化与变异导致其致病性的改变,N-GPV感染主要导致感染鸭生长发育障碍,肝脏、肠道等组织受损,且N-GPV能够感染雏鹅,危害水禽养殖安全。2.N-GPV感染导致鸭骨骼代谢紊乱N-GPV在宿主内的转录及复制造成了多种代谢物的差异表达。利用LC-MS技术,对21 d感染鸭喙和胫骨内差异代谢物进行筛选和分析,结果显示,N-GPV感染引起鸭喙和胫骨内核苷酸、磷脂类、氨基酸、糖类、脂类等代谢物差异表达,其中,氨基酸和核苷酸代谢相关的代谢物差异表达最显著。KEGG代谢通路分析结果显示,差异代谢物主要涉及代谢途径、钙信号传导途径等代谢相关通路。本研究对骨骼代谢相关生化指标进行筛选,发现睾酮、雌酮等与骨骼代谢相关的激素出现显著性差异表达,这表明,N-GPV病毒感染后,可通过影响睾酮、雌酮等激素表达水平,进而影响骨骼代谢。以上研究,明确了N-GPV感染后骨骼代谢物表达的差异变化,提示了N-GPV感染导致骨代谢紊乱的作用机制,为N-GPV导致SBDS的致病机制提供了数据支撑。3.N-GPV对骨骼发育的影响及作用机制本研究结果发现,N-GPV感染显著降低雏鸭骨骼指数、钙磷含量及骨密度,破坏骨骼代谢平衡,抑制骨骼发育。为探究N-GPV感染抑制鸭骨骼发育的机制,本研究以感染鸭胫骨作为研究对象,构建了雏鸭胫骨的基因表达谱,对转录基因表达谱进行注释和差异表达分析,21 d和35 d胫骨转录本分别得到1507个和1825个差异表达基因,主要涉及细胞生长与坏死、炎症反应、信号转导、骨骼免疫系统与发育等功能。在细胞损伤方面,差异表达基因主要涉及细胞凋亡、细胞坏死和细胞自噬,参与细胞死亡调控的主要为PI3K-Akt、ECM-receptor interaction及NF-kappa B等信号通路。骨骼发育方面,差异表达基因主要富集于转化生长因子-β信号通路、Wnt信号传导途径、PI3K-Akt信号传导途径等信号通路。N-GPV感染后,宿主细胞主要通过Toll样受体信号通路、NOD样受体信号通路、RIG-I样受体信号通路等进行病原识别,随后,宿主细胞通过JAK-STAT、NF-κB、IL-17等信号通路激活细胞免疫应答及炎症反应。转录组结果表明,N-GPV感染显著降低胫骨中BMP2、β-catenin、FGF2、OPG等基因的相对表达,提高了RANKL的表达及RANKL和OPG的比率,这提示N-GPV感染通过BMP/Smads信号通路、TGF-β信号通路、Wnt/β-catenin信号通路、FGF信号通路等抑制成骨细胞分化,通过RANKL/RANK/OPG信号通路增强破骨细胞活性,共同抑制雏鸭骨骼发育。以上研究,明确了N-GPV感染后与细胞损伤、骨骼发育及骨骼免疫相关基因的动态变化,在转录水平上明确了N-GPV感染抑制鸭骨骼发育的机制,为深入研究N-GPV感染后骨骼发育及宿主免疫应答反应提供数据支撑。4.N-GPV抑制骨髓间充质干细胞增殖分化的机制研究为了明确N-GPV抑制骨骼发育的发生机制,本研究选用骨髓间充质干细胞（BMSC）开展体外验证试验。研究发现,N-GPV感染显著降低BMSC细胞活性,导致细胞坏死与凋亡,并抑制BMSC细胞成骨分化作用。此外,N-GPV感染通过影响Wnt/β-catenin、BMP/Smads、FGF等信号通路中关键基因m RNA和蛋白水平的表达,抑制BMSC细胞的成骨分化作用,Wnt3a、BMP2和FGF2等通路激动剂的使用则明显逆转了N-GPV感染对BMSC细胞成骨分化的抑制作用,说明Wnt/β-catenin、BMP/Smads、FGF是N-GPV感染抑制BMSC细胞成骨分化的关键通路。同时,N-GPV感染BMSC细胞后,RANKL和OPG的比率显著升高,提示OPG/RANKL/RANK信号通路是N-GPV感染后抑制骨骼发育的关键通路之一。更为重要的是,我们对N-GPV感染抑制Wnt/β-catenin、BMP/Smads、FGF等信号通路的关键蛋白进行了筛选,结果表明NS1蛋白能够显著影响Wnt/β-catenin、BMP/Smads、FGF等通路关键基因的表达,进而推测其是潜在的骨骼发育抑制蛋白。综上,本研究明确了N-GPV抑制骨骼发育的损伤机理,发现并验证了N-GPV抑制骨骼发育的分子机制,并揭示了N-GPV抑制BMSC细胞成骨分化的具体机制,为探究N-GPV的致病机制研究提供理论基础,将有利于N-GPV感染的预防与治疗。