二穗短柄草根中木栓质脂肪醇合成基因的克隆与功能验证

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植物根部木栓质在植物抵御各种生物和非生物胁迫中具有重要作用。二穗短柄草作为麦类作物重要的模式植物,研究其与抗旱相关基因和机理,可为小麦等重要作物的研究提供借鉴。本论文通过气相色谱质谱联用仪(GC-MS)和气相色谱(GC)分析了二穗短柄草根中木栓质的组成和含量及其变化特点。利用拟南芥木栓质脂肪醇合成酶基因AtFAR1的蛋白序列在二穗短柄草数据库中分别进行同源比对,对获得的同源序列进行生物信息学分析,确定出了二穗短柄草木栓质脂肪醇合成酶相关的候选基因;分析候选基因在不同组织的表达特征,从中选择重要的候选基因进行了克隆和功能验证。研究结果如下:  1. 二穗短柄草根中木栓质组成成分有初级脂肪醇、脂肪酸、ω-羟基脂肪酸和α,ω-二羧酸,物质组成与已经发表的拟南芥和其他物种的木栓质组成成分相似。但是在组成成分的含量上存在一定的差异。  2. 二穗短柄草基因组中存在6个候选基因,共编码6个蛋白质。氨基酸序列多重比对后显示,只有BdFAR4 (Bradi3g20000)与AtFAR1具有50%以上的氨基酸一致性, BdFAR1(Bradi4g38460) 、 BdFAR2(Bradi3g42780) 、 BdFAR3(Bradi4g37860) 、 BdFAR4 (Bradi3g20000)、BdFAR5(Bradi1g73877)和BdFAR6(Bradi4g37860)与AtFAR1的氨基酸序列一致性分别是40.34%、42.30%、45.20%、50.80%、35.61%和44%。通过生物信息学分析,推测这些基因可能具有合成初级脂肪醇的功能。前期我们已克隆了BdFAR1、BdFAR2和BdFAR3,并已证明BdFAR1、BdFAR2和BdFAR3参与二穗短柄草叶片表皮蜡质中脂肪醇的合成;而BdFAR4主要在根中表达。因此,我们推测BdFAR4可能参与二穗短柄草根中木栓质脂肪醇的合成。  3. 在酵母中异源表达BdFAR4基因表明,BdFAR4具有编码脂肪酰基辅酶A的功能。通过构建酵母表达载体,转化酵母与提取酵母产物检测后,我们发现相比于空载体,转化了目的基因的酵母菌株中合成了链长为C20和C22的脂肪醇。  4.在番茄中异源表达BdFAR4基因表明,转基因番茄T1代的根中木栓质脂肪醇的含量显著增加,其中以链长为C20和C22的初级脂肪醇增加最多。与空载体植株相比,转基因植株根中木栓质脂肪醇的含量明显增加了1.4-1.7倍,其中链长为C20的初级脂肪醇增加了1.3-1.8倍,链长为C22的初级脂肪醇增加了1.4-1.8倍。综上结果表明BdFAR4具有合成木栓质脂肪醇的功能,并且主要合成链长为C20和C22的初级脂肪醇。
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