栝楼(Trichosanthes Kirilowii Maxim)，为葫芦科多年生藤本植物，由其根块制备而得的天然药物天花粉，作为传统中草药，在我国入药历史悠久，主要应用于引产。上世纪80年代，从栝楼根中分离出的天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)被证实为药物有效成分，为Ⅰ类核糖体失活蛋白，含247个氨基酸残基，通过N-糖苷酶活性使真核细胞核糖体失活。天花粉蛋白在国内被用于中期引流和治疗异位妊娠、胎盘残留和滋养层细胞肿瘤。近年来，研究发现，天花粉蛋白具有多种药理学活性，包括免疫调节、抗肿瘤和抗HIV。为此，天花粉蛋白日益引起广泛关注。 本实验中，我们特别关注天花粉蛋白的体外抗肿瘤活性。天花粉蛋白早已被证实是一种有效，且具有一定专一性的抗肿瘤药物，特别是对滋养层细胞来源的绒毛膜上皮癌有明显的抑制作用。目前，天花粉蛋白的抗癌作用研究主要集中在消化道肿瘤上，而对其它肿瘤细胞研究鲜见报导，对某些肿瘤细胞作用尚无定论。一直以来，天花粉蛋白被认为是栝楼抗肿瘤的活性成分，但从新鲜栝楼根得到的提取物对肿瘤细胞的作用，尚未见报导。为此，本实验选用肿瘤细胞株HepA—H(腹水型肝癌高转移株细胞)和HeLa(人宫颈癌肿瘤细胞)，以天花粉蛋白(TCS)浙矛1:人学了J!I一学位论文2(〕〔)4作用为对照，研究从鲜药材中分离出的括楼根提取物(。tracts叮、ri。}、。、、，n、he、ro〔)t tubor、，}二〔)‘})，又」两株!l，}，乡禽{红11胞生长抑制作用，进而比较了其’J起)’l’CS义寸IJ，}，J乍t{红I!jJ包fl勺于11)步几}i舌jJ近年来，从天然药物中，特别是中药，筛选诱导细胞凋亡类的抗癌药物已引三关汁了其远大前景研究成果颇多。们为’}月命右!4学和医学研究热点，细胞刁，’iJl’二业已展现。诱导细胞凋亡日11汀被公认为是治疗肿瘤最理想的有效途径之一。本实验在药物对细胞生长作用研究的琴础_匕首次研究了EOT对He助细胞诱份凋!’止作少IJ，为有效地气了一找新的抗肿瘤药物及进一步开发提供实验依据。研究目的比较分析EO『r不!I人花粉蛋I勺(肠iehosanthin，TCs)对腹水型肝癌高转移株细胞Hcp八一H和人护丫预婉Ilc恤细胞的‘}.’.长抑制作川，并进·步从细胞凋一亡的角度出发，探讨EOrr抑制He助细胞生长作用机制。研究方法从鲜药材枯楼根‘!，，捉取制务干占楼根提取物(EOT)，聚内烯酞氦凝胶!匕泳初步检测EOT成分，运川细胞体外培养技术，MTI，法检测药物的细胞毒作用，扫描电镜和透射电镜观察药物对细胞超微结构改变影响，电泳检测药物作川后细胞DNA产卜物化学特征的:l交一份，流式细胞术检测分析诱份细咆刁小、布与况。研究结果(l)EOT不!1 TeS犬寸1 lepA一H细jj包作川24h后，药物义、J‘红川泡生长具促进作少!」，无准效关系;361:后，细胞生长均受抑制，但无量效关系;48h后部分细胞‘}二长被抑制，部分细胞‘}毛长被促进，无l代效关系，，抢“数州均不具有统计意义(I，>0.〔)5)。EOT平}1 TCS对}1 eLa红Ilj袍作J)}效果明显(P<t)，05或P<0.01)，具有限好的叼一效、}，赴效关系(:>().8()4)。}边石药物浓度的升高，时问的延长，HeLa细胞’[长抑制率逐渐增高(I)<(川l)。又寸于EOT，刁们l司作用时‘I石J，丰111司药物浓度，其作J}j效果均优一J几TCS(P<〔川l)。其，l，作)IJ 36h，EOT对He劫红1!JJ包的ICS(j是115.6“岁ml，TCS为610.9。留Inl:了}j}J 48h，EOT义」.HeLa细J泡的IC50是33.4pg/，1、l，TCS为13().7、，留，111。(2)HeLa细J饱经EOT作川24h后，于1描电镜「，细胞jJq农If]j可见细胞表}川泡状突起的形成，微绒毛消失或丛本消失，夕卜可见分离出的周f二小体。透射电镜卜，细{}包体积缩小，微绒毛消失，核固缩，染色质浓集浙江人学硕卜学位论文2004靠近于核膜，并沿核膜收缩，可见具有完整膜性结构的凋亡小体的分离。(3)HeLa细胞经EOT 50 pg/ml、100林g/ml、500 pg/ml分别作用24h后，DNA琼脂糖凝胶电泳可见细胞凋亡特征性的梯形条带(ladderpatteI’n);随着时间延长，50协g/ml和100 pg/ml作用组，48h后，DNA ladder更趋明显，但高浓度药物(500pg/ml)作用组，电泳谱呈涂片状(smear)，说明凋亡细胞继发性坏死。(4)流式细胞术分析显示，同一浓度(100 pg/m1)EOT分别作用HeLa细胞12、24、36、48h，细胞凋亡率随着时间的延长而逐渐升高:不同浓度EOT分别作用HeLa细胞48h，药物诱导细胞凋亡的作用呈现浓度依赖性增强的趋势，但是高浓度药物(500林g/m1)作用则导致细胞坏死。100”g/ml作用48h，HeLa细胞凋亡率达到高峰29.76%。结论不同的肿瘤细胞对药物作用的敏感性不同。H叩A一H细胞对EOT和TCS不敏感，作用不明显;而HeLa细胞对EOT和TCS敏感，细胞生长受抑制作用显著，且呈良好的时效、量效关系，其中EOT抑癌活性明显强于TCS;EOT对HeU细胞有较强的诱导凋亡作用，具有潜在的治疗相关癌症的药物价值，值得进一步深入研究。