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莪术,据《中国药典2015版》记载,其性味辛、苦、温,归肝、脾经,能行气破血,消积止痛,用于癥瘕痞块,瘀血经闭,胸痹心痛,食积胀痛。中医理论可通过清热凉血,活血化瘀的方剂治疗银屑病,与莪术功效相符。在银屑病的治疗中,多采用莪术发挥消炎活血的作用。课题组前期工作表明,莪术醇提物对银屑病动物模型有治疗改善作用,但莪术治疗银屑病的物质基础及作用机制仍不明确。HaCaT细胞繁殖能力强,免疫学特性与表皮角质形成细胞高度类似,是研究银屑病的最佳选择。本论文拟采用HaCaT细胞,研究莪术主要有效成分的作用效果及对NF-κB炎症信号通路的影响,为莪术治疗银屑病提供理论依据,并为莪术的进一步开发应用奠定基础。实验方法:一、用不同浓度的TNF-α、IFN-γ或TNF-α/IFN-γ联用,处理细胞6h、12h、24h、48h,采用CCK-8法检测细胞活力,根据细胞活力选择合适的细胞处理条件,复制细胞增殖模型,得到与银屑病患处相似的细胞生理特点。二、在细胞模型的基础上,用莪术醇、莪术烯醇、吉马酮、异莪术烯醇、莪术呋喃二烯酮、莪术二酮、β-榄香烯、姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素十种成分不同浓度分别处理HaCaT细胞24h、48h,计算不同成分的IC50值;选择作用效果较好的成分,分为高中低三个浓度组处理细胞模型,应用流式细胞术分析不同成分对细胞周期和凋亡的影响。三、用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定不同处理条件下细胞中IL-1β、IL-6、IL-8、IL-33四种炎症因子的分泌量,用蛋白质印迹法即Western Blot检测细胞中NF-κB p65、p-p65、IκB-α、Bcl-2/Bax蛋白的表达,用实时荧光定量PCR(RTPCR)考察信号通路中信号转导受体TRADD、TRAF2的mRNA的表达量,分析有效成分作对NF-κB信号通路的影响。实验结果:一、处理6h或12h:TNF-α、IFN-γ或TNF-α/IFN-γ联用各浓度组无明显促增殖作用(P>0.05)。处理24h:TNF-α组50ng/ml和100ng/ml两个浓度组有显著促进增殖的作用(P<0.01或P<0.05),IFN-γ组细胞较空白组OD值有增高趋势(P>0.05),TNF-α/IFN-γ联用组6.25ng/ml组有明显的促进增殖的作用(P<0.05)。处理48h:TNF-α呈浓度依赖性促进细胞增殖(P<0.01),IFN-γ6.25ng/ml处理组可促进细胞增殖(P<0.01),TNF-α/IFN-γ联用组无法有效促进细胞增殖。二、增殖抑制实验中,各成分处理48h IC50优于24h,其中,莪术烯醇、莪术二酮、吉马酮、β-榄香烯、姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素可显著抑制TNF-α诱导的HaCaT细胞增殖(P<0.01或P<0.05),作用稳定;周期实验中,莪术烯醇、莪术二酮、吉马酮、姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素组G1期细胞增多,吉马酮高浓度组G2期增多;凋亡实验中,各成分均可以不同程度促进细胞凋亡。三、莪术烯醇、莪术二酮、吉马酮、β-榄香烯100μg/ml,姜黄素、去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素10μg/ml,可显著抑制TNF-α诱导的IL-1β、IL-6、IL-8、IL-33四种白介素因子的过表达(P<0.01或P<0.05),可不同程度抑制NF-κB信号通路IκB-α、p-p65蛋白和信号转导受体TRADD mRNA和TRAF2 mRNA的表达。实验结论:莪术有效成分莪术烯醇、莪术二酮、吉马酮、β-榄香烯、姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素可显著抑制TNF-α诱导的HaCaT细胞增殖,阻滞细胞周期并诱导细胞凋亡。有效成分可抑制TNF-α诱导的炎症因子过表达,抑制相关转导蛋白的表达,说明莪术有效成分可抑制TNF-α诱导的NF-κB信号通路激活。