[研究背景与目的]胃癌发病率、死亡率均较高。胃癌与其他恶性肿瘤相类似,是一种细胞周期与凋亡调控紊乱性疾病,其发生与发展与诸多的周期与凋亡相关调控基因产生质和/或量变化密切相关,胃癌细胞在这些遗传性发生变化的基因作用下完成每一个细胞周期,表现为细胞的失控性凋亡抑制与无限增殖。因此,识别胃癌周期与凋亡相关基因并深入研究对于阐明胃癌无限增殖机理及选择合适的胃癌治疗靶点都具有意义。我们前期用SEREX(Serological Analysis of Recombinant cDNA Expression Libraries)方法筛选出胃癌相关基因PHF10,目前已初步阐明了其与胃癌密切相关。目前认为PHF10的过表达与实体瘤的发生有关,PHF10在数种实体瘤组织中存在过表达,均提示PHF10具备癌基因特点。本课题旨在进一步探明PHF10在胃癌发生发展中的具体分子通路及生物学作用机制。　　 [方法]我们先用Q-RT-PCR、Western blotting和IHC检测PHF10在胃癌细胞和组织中的表达情况及细胞定位。遂应用RNAi下调胃癌细胞中PHF10表达,观察PHF10表达下调后细胞生物学行为改变。应用细胞同步化技术和蛋白表达分析我们检测PHF10降解变化周期与细胞周期的相关性。泛素-蛋白酶体途径是目前已知的所有真核生物体内最为重要和高度选择性的蛋白质降解途径,它不仅参与破坏陈旧或损伤蛋白质,而且还参与调节基因转录、受体胞吞、抗原呈递、细胞周期、细胞增殖与分化以及信号转导等多种细胞生理过程。我们首先通过对周期蛋白中的调节因子筛选与对PHF10结构预测来验证GSK-3β与PHF10磷酸化后引起的蛋白泛素化降解相关性。构建一系列PHF10的磷酸化位点突变体,并进行转染或共转染PHF10相对低表达的MKN28细胞,筛选出具有GSK-3β磷酸化位点并介导泛素化降解过程的关键靶点。通过免疫沉淀,Western-blotting和激酶实验验证PHF10的磷酸化状态与GSK-3β水平和不同活性状态间相关性。有报道PHD家族蛋白参与泛素化或自身泛素化过程(泛素化连接酶3),为排除PHF10周期性降解可能是由PHD结构的泛素化连接酶功能引起的泛素化或自身泛素化过程,通过突变体及in vitro泛素化实验我们检测了PHF10的降解过程。最后,我们分别通过3D-matrigel实验和动物模型阐明了PHF10在细胞分化中的作用。此外,对PHF10下调后的蛋白表达谱的筛选,检测下游靶蛋白发生的相应变化。利用酵母双杂交系统检测PHF10转录调节活性,应用荧光素酶实验检测PHD结构域对PHF10的转录调控中的功能。为进一步探讨PHF10与靶分子的结合位点我们构建了一些列的caspase-3启动子区域截断体,通过荧光素酶实验检测PHF10对caspase-3各区段转录活性影响。另外,我们对胃癌细胞MKN28和SGC7901细胞进行内源性及外源性PHF10蛋白的ChIP实验验证PHF10对caspase-3启动子区的直接相互作用和转录调控功能。　　 [结果]　　 应用细胞同步化和蛋白表达分析方法我们发现PHF10的降解变化周期与细胞周期一致,并且与G1期长短密切相关,PHF10参与了G1期的加速,从而阻碍胃癌细胞分化和促进胃癌细胞的去分化过程。通过对周期蛋白中.的调节因子筛选和对PHF10的结构预测,我们发现PHF10蛋白上有多个DSGXXSX区域,预测PHF10的周期性降解可能与GSK-3β的磷酸化调控引起的蛋白泛素化降解有关。为证实这点我们构建了一些列PHF10的磷酸化位点突变体,并进行转染或共转染MKN28细胞,我们发现其中2SA3片段(247-251位)转染后PHF10降解程度不明显,由此我们推断这个片段中的的两个位点对于GSK-3β的磷酸化PHF10并由此介导的PHF10降解起着至关重要的作用。通过免疫沉淀,Western-blotting和激酶实验我们验证了PHF10的磷酸化状态与GSK-3β的表达水平和活性形式密切相关。为排除PHF10泛素化可能由PHD结构的泛素化连接酶功能引起的自身泛素化过程,通过对PHF10各个结构域突变体in vitro泛素化实验我们证实了PHF10的降解的确存在自身泛素化过程参与。3D-matrigel实验和动物模型结果揭示了PHF10表达水平与胃癌细胞分化密切相关,基因干扰至PHF10表达水平降低后胃癌细胞在体内外都有促进胃癌细胞的再分化和抑制肿瘤细胞生长作用。　　 另外,我们应用Q-RT-PCR、Western-lotting和IHC实验检测PHF101在胃癌细胞中的表达情况及细胞定位,发现与胃粘膜永生化细胞株相比,在胃癌细胞中PHF10表达水平较高,并且激光共聚焦显微镜检测结果显示PHF10定位于细胞核内。遂我们应用RNAi下调PHF10表达水平,观察PHF10下调后细胞生物学行为改变,发现PHF10与胃癌细胞增殖和凋亡密切相关。通过对蛋白表达的筛选,我们发现PHF10上调或下调后caspase-3及其下游靶蛋白发生相应的负性变化。另外,利用酵母双杂交系统阐明了PHF10的负性转录调节活性,应用荧光素酶实验,我们发现PHF10蛋白中的PHD结构域对PHF10的转录抑制调控起关键作用。我们还构建了一些列的caspase-3的启动子区域截断体,通过荧光素酶实验我们发现PHF10对caspase-3的-270-170区段具有转录抑制活性。对MKN28和SGC7901细胞进行内源性及外源性PHF10蛋白的ChIP验证,结果表明PHF10对caspase-3有转录调控作用,并且他们间的相互作用是直接的,由此我们进一步验证了PHF10参与了caspase-3的转录抑制调控,证明了PHF10能够通过对caspase-3的转录调控而参与了胃癌细胞的凋亡抑制。　　 [结论]PHF10在胃癌组织和细胞系中存在过表达,并与胃癌的分化相关临床病理参数相关,可将其作为反映胃癌的生物学特性一个新的候选指标。PHF10在胃癌细胞周期中呈周期性的表达,尤其PHF10在胃癌细胞G1期完成细胞分化事件中与GSK-3β共同发挥至关重要的调节作用,阻断PHF10作用可导致胃癌细胞在体内外增殖减慢及分化成熟,提示其可能作为胃癌治疗的潜在靶点。另外,我们发现PHF10的过表达与对caspase-3的转录抑制调节而参与凋亡抑制。并且,PHF10蛋白中的两个PHD结构域对caspase-3的转录抑制调控起关键作用,这个发现不仅为基因靶向治疗提供了新的靶点,还将为针对PHD结构域的小分子基因靶向治疗的实现提供新的可能。