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细胞是生命活动的基本单兀,在细胞层次展开的研冗将为人们认识和了解生命活动的本质奠定基础。迄今,对于细胞的研究大致可以分为两类:一类是对于在正常和病理状态下细胞形态学展开的研究;另一类是针对细胞在不同病理条件下胞内外物质变化规律展开的研究。前者随着细胞成像技术的发展,尤其是各种荧光探针以及纳米结构的相继涌现,在细胞形态和功能的成像研究中发挥着越来越大的作用。后者随着多种分子检测技术的发展,使人们充分了解到细胞复杂的信号转导通路以及涉及各种生理过程的蛋白分子、DNA与RNA、氨基酸、小分子物质的相互作用机制。本论文旨在通过电分析化学与细胞生物学的交叉与融合,利用电化学原理,发展可用于细胞分析的电化学分析新原理和新方法。具体工作概括如下:
(1)利用Ca2+和Mg2+对NADH电化学催化氧化的增强作用,发展了细胞外Ca2+和Mg2++高选择性电化学分析的新方法。利用所建立的方法,研究了心肌细胞在解偶联剂FCCP诱导的缺氧过程中胞外Mg2+的连续变化规律,并发现了FCCP的加入可使细胞密度为2.0×105cells·mL-1的心肌细胞胞外Mg2+的浓度在30min内下降40%±10%(n=3)。同时,率先发现了Ca2+和Mg2+对NADH电化学催化氧化的增强作用与Tris浓度之间具有依赖性。并基于此依赖关系,在优化Tris浓度的基础上,发展了细胞外Ca2+选择性测定的电化学分析新方法,并将其应用于心肌细胞在FCCP诱导的缺氧过程中胞外Ca2+变化规律的研究。实验结果表明,16μMFCCP的加入可使细胞密度为2.0×105cells·mL-1的心肌细胞胞外Ca2+的浓度下降了30%±10%(n=3)。本研究率先利用电化学方法研究了生理和缺氧状态下细胞外Ca2+和Mg2+的动态变化,为细胞外Ca2+和Mg2+的实时分析提供了新的简单的方法,在细胞缺血损伤分子机制的研究中具有重要的意义。
(2)利用电化学阻抗原理,发展了可用于细胞膜通透性研究的阻抗分析新方法,并将该方法应用于FCCP诱导的犬肾细胞(MDCK)缺氧过程中细胞膜通透性变化的研究。结果表明,随着电极表面生长的MDCK细胞缺氧时间的增长,探针分子的电荷传递电阻变小。8μMFCCP的加入可使MDCK细胞的阻抗值前30分钟内下降80%±5%(n=3),并基本达到稳定。高浓度的FCCP可促使MDCK细胞的阻抗值在更短的时间里下降达到稳定。这些现象均由于MDCK细胞缺氧过程中细胞膜通透性变化所造成的。本研究发展了一种可以用于测定细胞膜通透性变化的电化学阻抗新方法。
(3)基于葡萄糖/过氧化氢生物燃料电池技术,构筑了两极燃料均为葡萄糖的自发电式葡萄糖传感器,并将其应用于细胞能量代谢的研究。实验结果表明,在相同的细胞密度下(2.0×106cells·mL-1),犬肾细胞(MDCK)消耗葡萄糖的速率明显快于鼠源成纤维细胞(3T3)。此基于酶型生物燃料电池技术发展的自发电式葡萄糖传感器,具有装置简单、操作方便等优点,可用于细胞能量代谢研究,可望应用于重要生理物质的活体实时原位分析。