非编码RNA和基因Rik08在男性不育中的功能研究

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近年来不育症正在成为影响人类健康的重要困扰,数据表明约有10%-15%育龄夫妇无法正常生育,其中一半因素来源于男性。因此,研究造成男性不育的相关疾病的机制显得愈发重要,我们针对隐睾症、睾丸癌和基因缺失造成的睾丸发育停滞进行了深入的研究。  已经有大量报道证明microRNAs(miRNAs)具有强大的生物学功能参与生物体内基因的调控,在精子发生和发育中也起着重要作用。我们研究组之前有关成熟阻滞型不育患者的miRNA表达芯片数据表明在不育患者中miR-210的表达量显著升高。然而,miR-210在精子发生中的作用和功能还尚未被报道过。经过研究我们发现,miR-210不但在不育患者中高表达,同时也在隐睾患者的睾丸组织中高表达。此外,miR-210通过直接靶向核受体亚家族成员NR1D2的3UTR区域抑制其表达,特别是在隐睾患者睾丸组织中的表达。为了探究更加深入的机制,我们在体外建立小鼠隐睾模型,从模型中可以看到miR-210在隐睾小鼠睾丸中表达量显著上升,这一数据与隐睾患者中的表达趋势呈现一致。根据我们所得到的实验结果,我们认为miR-210可以成为检测隐睾发生的临床生物学标记物。  此外,中等尺寸的非编码rna(imsncRNAs)虽然被提及较少,但是已被证明在几种真核生物体内起着重要的调控作用。在本文的第二项研究中我们选择了在测序结果中显示在寡精子症患者中差异表达的非编码RNA---imsnc761作为研究对象。首先我们证实了imsnc761在成熟阻滞型不育患者中表达下调。同时我们发现imsnc761可以与RNA解旋酶DDX6相互作用,通过p53途径诱导NT2细胞凋亡和增殖抑制。imsnc761和DDX6之间的相互作用也抑制线粒体功能和特异基因转录和翻译。为了进一步探究其内部机制,我们利用label-free定量蛋白组学方法进行测序,通过KEGG分析和GO分析,找到了在imsnc761和DDX6共同作用时NT2细胞内差异表达的信号通路和分子元件等。imsnc761序列同时也被鉴定为snoRNA,我们的研究第一次指出DDX6可以和中小片段的RNA相互作用调节睾丸癌细胞的增殖和凋亡。  精子发生中除了非编码RNA对整个过程进行表观遗传学调控外,还有大量仅表达在睾丸的基因对于睾丸的发育和精子的生成也有着重要的影响。在本论文第三部分研究成果中,我们选择了在睾丸中特异性表达的基因Rik08作为研究对象,利用CRISPR技术构建了特异性敲除该基因的缺陷型小鼠。随后我们发现纯合子雄性Rik08缺陷小鼠睾丸发育缓慢,生精过程停滞,不能产生成熟的精子亦不能生育。经过实验近一步证实,在激素表达正常的情况下,Rik08-/-小鼠精子发生停滞在粗线期精母细胞时期。同时,我们利用出生后16天的野生型和Rik08-/-小鼠的睾丸进行定量蛋白质组学测序,之后利用生物信息学网站对差异蛋白进行聚类分析,找出其中五个与减数分裂直接相关的基因作为更加深入研究的切入点。
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