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本论文对产氢红杆菌(Rhodobactersp.)R7菌株进行了以下方面深入研究:采用分光光度法探求了产氢红杆菌在产氢和非产氢条件下的色素合成规律;研究了产氢影响因素供氢体、氮源和生长因子对产氢红杆菌细胞生长、类胡萝卜素表达和合成量的影响;并对产氢红杆菌的类胡萝卜素进行了提取分离和初步纯化。为进一步阐明产氢红杆菌光合产氢机制,本文对生长条件下和产氢条件下的产氢红杆菌的色素蛋白复合体进行了分离纯化,并初步研究了其生物活性。主要实验结果如下:
●光合色素的合成具有时序性,R7菌株首先合成可吸收近红外光的细菌叶绿素,而370nm和590nm组分的细菌叶绿素的合成则晚于类胡萝卜素,426nm类胡萝卜素含量的变化引起捕光色素复合体和光反应中心复合体比率的改变。在乙酸钠供氢体体系中,分别用酵母提取物和谷氨酸钠替代生物素和硫酸铵后可使细胞生物量提高37.9%和20.4%。乙酸钠供氢体可诱导细胞进行球形烯和球状菌素类胡萝卜素代谢,苹果酸钠和谷氨酸钠有利于426nm类胡萝卜素组分的产生,但不利于450nm类胡萝卜素组分的积累。酵母提取物可显著提高类胡萝卜素产量,并改变类胡萝卜素合成途径。
●分别采用有机溶剂浸提超声波处理和不处理方法分离提取产氢红杆菌细胞类胡萝卜素。结果表明,超声波处理和不处理对产氢红杆菌光合色素的提取量影响较小。吸收光谱表明,丙酮—甲醇(V/V7∶2)浸提3次可较完全提取光合色素,最佳浸提时间为2小时。采用薄层层析方法分析初步纯化到黄色、红色、浅黄色和浅红色4种类胡萝卜素组分,黄色和红色为主要类胡萝卜素组分。吸收光谱法进一步研究表明,黄色组分为球状菌素(Spheroidenone)。
●采用溶解酶和超声波相结合的破壁方法,以十二烷基二甲基胺氧化物(LDAO)作为膜蛋白的增溶剂,对生长和产氢条件下产氢红杆菌的色素蛋白复合体进行了硫酸铵分级分离和DEAE—纤维素32离子交换层析纯化。经UV-VIS光谱分析和电泳检测结果表明:LDAO对生长和产氢条件下产氢红杆菌膜蛋白构象有明显的影响作用;从生长培养基培养的菌体中,分离纯化得了RC和LH2色素蛋白复合体,LH2色素蛋白复合体在800nm和850nm处出现特征吸收峰。SDS-PAGE表明RC的L、H、M三个亚基的分子量均在30-35KD,LH2a、β亚基分子量在6-7KD;在产氢培养基培养的菌体中分离获得了RC-LH1色素蛋白复合体,Tricine-SDS-PAGE分析反应中心(RC)的L、H、M亚基分子量约在25-30KD,LH1a、β亚基分子量分别约为6KD。
●分别以493nm、512nm、800nm为激发光,扫描LH2的荧光光谱,LH2可均在850nm处出现一特征荧光峰,结果表明:分离产物LH2具有光能捕获和光能传递的生物活性。为下一步的色素蛋白复合体与产氢之间关系研究奠定了基础