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结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是一类常见的消化道恶性肿瘤,具有高发病率高和死亡率高的特点。仔细发掘结直肠癌背后的致病因素,改进结直肠癌的预防、诊断、治疗及预后措施,是研究者们面临的一大严峻课题。microRNAs(miRNAs)是一类长约19-23nt的单链非编码小RNA。miRNAs主要通过结合靶基因的mRNA,抑制mRNA翻译或者引起mRNA的降解,从而抑制靶基因的表达,影响各种生理病理活动。在癌症发生时,癌细胞中多种miRNAs的表达会发生变化,进而影响下游靶基因的表达,最终影响癌症的发生发展。研究癌症中异常变化的miRNAs及其参与癌症进程调控的机理,对于癌症的研究和治疗具有重要的意义。本研究中,我们分别探讨了结直肠癌中两个重要的癌症相关miRNAs(原癌miRNA miR-181a和抑癌miRNA miR-27b)通过抑制各自靶基因(抑癌基因SRCIN1和癌基因ATG10)在结直肠癌血管生成以及在奥沙利铂耐药中发挥作用的机制,为结直肠癌血管生成治疗以及逆转奥沙利铂耐药寻找新的思路。研究内容主要分为两部分。论文第一部分开展了miR-181a通过下调抑癌基因SRCIN1促进结直肠癌血管生成的分子机制的研究。我们首先对结直肠的癌组织与癌旁组织进行miRNA芯片筛选,发现miR-181a在结直肠癌组织中表达上调,同时14对结直肠癌组织的实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测证实了miR-181a在结直肠癌组织中高表达,且与结直肠癌的预后呈显著的负相关。我们进一步通过过表达或者敲低结直肠癌细胞中miR-181a的水平,将结直肠癌细胞与血管内皮细胞共培养之后,发现过表达miR-181a的结直肠癌细胞可以促进内皮细胞成环,反之,则抑制内皮细胞成环。体内的基质胶塞实验结果也显示miR-181a可以促进肿瘤组织的血管生成。接下来,我们通过生物信息学预测,寻找到了miR-181a可能的靶基因SRCIN1,荧光素酶报告实验证实miR-181a可以与SRCIN1的3’UTR直接结合。临床样本的验证发现,SRCIN1在结直肠癌组织中低表达,且与miR-181a的表达水平呈显著负相关。接下来我们在细胞水平证明了miR-181a在转录后水平调控SRCIN1的表达。另外我们发现miR-181a对SRCIN1的抑制构成了miR-181a/SRCIN1/SRC/VEGF调节轴的核心。同时,我们证明了SRCIN1作为抑癌蛋白,可以抑制血管新生。回复实验证明,miR-181a是通过抑制SRCIN1进而抑制血管新生的。最后,我们得出结论,即结直肠癌细胞中高表达的miR-181a抑制了SRCIN1的表达,进而激活了SRC/VEGF通路,肿瘤细胞分泌的VEGF增多,作用于微环境中的血管内皮细胞,最终促进血管生成。论文第二部分我们开展了miR-27b通过下调ATG10抑制自噬进而促进结直肠癌对奥沙利铂敏感性的机制研究。首先我们采用梯度诱导法成功构建对奥沙利铂耐药的结肠癌细胞株。接下来我们利用芯片技术和实时荧光定量技术检测在敏感与耐药的结肠癌细胞株中差异性表达明显的miRNAs。进一步的功能实验显示,miR-27b在所有的异常表达的miRNAs中对逆转结直肠癌耐药的作用最为显著,且miR-27b可以显著促进细胞凋亡。接下来,我们证明了细胞自噬促进了结直肠癌的耐药,且miR-27b可以抑制细胞自噬。利用生物信息学软件,我们预测出miR-27b可能调节的自噬相关基因(ATG10,ATG4C,ATG2A,ATG2B)。进一步经过荧光素酶报告实验筛选,我们发现miR-27b对ATG10的下调作用最为明显。在耐药细胞株中ATG10表达升高。我们进一步检测了结直肠癌组织样本,发现在癌组织中miR-27b含量显著下降,并且与ATG10蛋白水平的变化显著负相关。接下来我们在细胞水平证明了miR-27b可以通过直接结合到ATG10的3’UTR而抑制ATG10蛋白的表达。通过回复实验,我们证明miR-27b是通过直接抑制ATG10的表达,抑制细胞自噬,逆转化疗耐药的。另外我们发现miR-27b对ATG10的抑制构成了c-Myc/miR-27b/ATG10调节轴的核心。综上所述,我们的研究发现了结直肠癌中重要的调节轴(miR-181a/SRCIN1/SRC/VEGF以及c-Myc/miR-27b/ATG10)在结直肠癌进程中的重要作用。我们的结果揭示了miRNAs在结直肠癌的血管生成以及化疗耐药中的重要功能,反映了miRNAs与靶基因调控关系的复杂性,为结直肠癌的治疗提供了新的靶点和思路。