研究背景膀胱癌是泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤,主要指尿路上皮癌,包括非肌层浸润性膀胱癌和肌层浸润性膀胱癌。非肌层浸润性膀胱癌是指肿瘤局限于膀胱粘膜层及粘膜下层,未侵犯肌层,约占膀胱癌的75%,又称为浅表性膀胱癌。目前虽然经尿道膀胱镜肿瘤切除配合手术后的膀胱内灌注化疗药物,已经成为浅表性膀胱癌的标准治疗方法,但仍有约2/3的患者术后会出现肿瘤复发,并且复发患者中还会有部分病例可进展为更高的肿瘤病理分级。肌层浸润性膀胱癌(muscle-invasive bladder cancer, MIB C)是指临床分期为T2-T4的膀胱癌,占初发膀胱癌的25%,恶性程度高,进展比较快,预后较差。根治性膀胱切除术(Radical Cystectomy, RC)是目前肌层浸润性膀胱癌的标准治疗方法,根治性膀胱切除术结合顺铂为基础的联合化疗已经被用来改善晚期及浸润性膀胱癌患者的预后,是提高晚期和浸润性膀胱癌患者的生存率、降低肿瘤复发和远处转移的有效方法。目前对于肌层浸润性膀胱癌来说,最常用的化疗方法是MVAC方案(甲氨蝶呤、长春新碱、多柔比星和顺铂)和GC方案(吉西他滨和顺铂)。上述方案中均含有顺铂,表明顺铂(CDDP)在化疗中的重要作用。顺铂作为铂类抗癌药物的代表,是膀胱癌化疗方案中的主要药物。尽管上述联合化疗方案已取得了明显的疗效,但同时也给患者带来了比较严重的化疗毒性反应,而且在使用一段时间后,有可能会出现肿瘤的化疗耐药。由于肿瘤化疗耐药性的发生,只有15-20%的病人可以获得长期生存率。因此,为克服铂类化疗药物的耐药性及改善化疗的有效性,寻找新的克服化疗耐药性及提高化疗敏感性的分子靶向指标已经成为近期研究的热点,以求提高化疗的效率,有效地减少化疗的毒性,从而能够为晚期浸润性膀胱癌患者延长生存时间,改善预后,获得更好的生活质量。Akt,又称为蛋白激酶B,是P13K/Akt信号通路中重要的下游调节因子,占据着核心枢纽的地位,包括三种亚型,Akt1,Akt2和Akt3.Akt作为P13K/Akt信号通路中重要的调节因子,能够调节下游多个效应因子的表达,如mTOR,GSK3,BAD,Bcl-2,4EBP1,70S6K等,从而调控细胞生长、增殖、凋亡、蛋白合成、细胞周期运转等等。已有研究表明,Akt在正常细胞及组织中发挥着重要作用,可以调节细胞生长、增殖、存活、代谢。很多学者研究显示Akt信号通路的失调与肿瘤、糖尿病、心血管疾病及神经系统疾病密切相关,尤其是肿瘤。研究发现Akt通路的激活与多种肿瘤的发生、进展、转移等息息相关,包括肺癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、血液系统疾病等等,并且Akt可以通过调节下游多通路来促进肿瘤的发生与进展。因此,Akt是P13K/Akt信号通路中的核心治疗靶点,通过调节Akt的表达来调控肿瘤细胞的增殖与凋亡之间的平衡,从而达到抑制肿瘤生长增殖,诱导肿瘤细胞凋亡的效果。P13K活化后激活Akt,即Akt发生磷酸化,Akt的两个磷酸化位点Thr308和Ser473。激活的Akt可以诱导细胞生长增殖,抑制肿瘤细胞的凋亡,从而发挥促进肿瘤发生进展的作用。根据这一机制,目前的Akt靶向抑制剂,通过降低Akt及下游效应分子的磷酸化水平的表达,来达到抑制肿瘤细胞生长、促进肿瘤细胞凋亡的作用。此外,Akt信号通路的激活与化疗耐药性及放疗抵抗性也有密切关系。在泌尿系肿瘤中,已有研究通过免疫组织化学染色方法证实了Akt信号通路在膀胱癌组织中过表达,且Akt通路的激活程度与膀胱癌的进展密切相关,即在浸润性膀胱癌中的Akt表达水平明显高于非浸润性膀胱癌。同时,Akt也与膀胱癌的预后相关,伴有磷酸化Akt过表达的膀胱癌患者,生存时间明显降低,且发生死亡的风险更高。学者Kreisberg及Shimizu等对Akt在前列腺癌的预后中起到的作用做了详细的研究,结果表明Akt及磷酸化Akt表达水平的增高与更高的前列腺癌病理分级有关,是提示前列腺癌患者不良临床预后的独立预后指标。鉴于Akt信号通路在肿瘤中的重要作用,Akt就成为了肿瘤靶向治疗的焦点,Akt抑制剂也就随着研究的不断进展而产生。Akt抑制剂通过阻断磷酸化Akt的表达,从而抑制通路中下游多个效应因子的活性,达到抑制肿瘤的增殖及进展的效果。在本次研究中,我们选择了MK2206,一种高效的变构Akt抑制剂,MK2206已经进入I期临床研究。近年来,研究不仅局限在应用单药Akt抑制剂对肿瘤的影响,最近通过使用Akt抑制剂联合化疗药物作用于Akt通路,已经成为肿瘤治疗研究的新热点。Akt抑制剂与化疗药物可互相协同,起到更好的杀伤肿瘤细胞的作用,而且还可以联合抑制Akt通路中的下游效应分子来发挥拮抗肿瘤的化疗耐药及提高化疗敏感性的效果。但是目前并没有Akt抑制剂MK2206联合顺铂对膀胱癌的疗效,也没有能否通过抑制Akt信号通路来提高膀胱癌对顺铂的敏感性和降低顺铂的耐药性的相关性研究。在此次研究中,研究者申请并获得了山东大学海外留学基金委的资助,在日本京都大学医学研究科和山东大学附属省立医院探讨了Akt信号通路在膀胱癌的进展、侵袭,克服肿瘤的顺铂耐药性及提高顺铂敏感性中的重要作用及分子机制,从而为提高膀胱肿瘤的铂类联合化学药物治疗效率提供了新型方法。目的本研究首先探讨了Akt信号通路中多个效应因子的表达水平与膀胱癌的进展之间的关系,然后通过Akt靶向抑制剂MK2206对膀胱癌细胞作用后,研究MK2206在提高顺铂(CDDP)诱导的对肿瘤细胞毒性及凋亡中的作用,进而为探索新的增强肿瘤细胞化疗敏感性的分子指标及可能的加速杀伤肿瘤细胞作用机制,改善传统的化疗方案提供新的实验依据。方法(1)培养膀胱癌细胞并通过免疫印迹方法检测各种细胞株中Akt及Akt信号通路中下游分子的表达水平,包括RT112,RT4,253J,J82, T24, UMUC3等。(2)采用细胞活性实验(四甲基偶氮唑蓝法,MTT)法检测MK2206和CDDP各自对膀胱癌细胞的抑制作用,计算CDDP的半数抑制浓度(50%inhibiting concentration,IC50),并然后通过免疫印迹方法检测各膀胱癌细胞在MK2206和CDDP各自作用后的磷酸化Akt及凋亡相关蛋白的表达情况；通过MTT检测MK2206+CDDP的联合治疗对各膀胱癌细胞(RT112,253J,UMUC3,T24)的生长抑制作用,并通过免疫印迹方法检测联合治疗后的T24及RT112中Akt信号通路中各分子指标的表达水平及凋亡相关蛋白的表达情况,探讨联合治疗中MK2206增加CDDP诱导的对肿瘤细胞毒性及凋亡的分子通路机制。(3)采用Transwell细胞侵袭实验检测MK2206抑制浸润性膀胱癌细胞株UMUC3的侵袭能力,并通过免疫印迹方法检测与侵袭有关的上皮间充质转化(EMT)中各指标snail,slug及ZEB1的表达水平变化,探讨MK2206抑制细胞侵袭能力的作用机制。(4)采用膀胱癌细胞株RT112建立膀胱癌动物模型(小鼠皮下肿瘤模型),研究各种药物的体内治疗肿瘤的效果；采用腹腔注射的方法将药物注射到小鼠体内并分组,对照组(DMSO)、CDDP组、MK2206组、MK2206+CDDP组,观察各组中对膀胱癌皮下肿瘤生长的影响情况,并通过免疫组织化学染色的方法检测四组动物模型中的皮下肿瘤标本的Ki-67表达,分析各组药物对肿瘤细胞增殖的抑制情况。结果(1)蛋白免疫印迹检测在肌层浸润性膀胱癌细胞株中(253J,J82,T24, UMUC3)磷酸化Akt及下游的效应分子表达增强,而在非肌层浸润性膀胱癌细胞株中(RT112,RT4)磷酸化Akt及下游的效应分子无表达或弱表达。(2)MTT细胞活性实验检测MK2206(500nM)联合CDDP可以提高CDDP诱导的对肿瘤细胞毒性作用,从而增加膀胱癌肿瘤细胞对CDDP的敏感性。蛋白免疫印迹检测到联合CDDP治疗,MK2206(500nM)可以增强CDDP引导的肿瘤细胞凋亡效应,而这种凋亡效应依赖于磷酸化Akt及其下游效应分子表达水平的抑制。(3)MK2206(500nM)抑制磷酸化Akt及下游效应分子表达水平,还可以抑制UMUC3的侵袭能力,并且抑制侵袭相关蛋白snail,slug及ZEB1的表达水平,这些指标也与化疗敏感性密切相关。(4)体内试验结果表明联合治疗组(MK2206+CDDP)能抑制皮下肿瘤的生长趋势,而且能明显抑制肿瘤细胞的增殖情况。结论(1)磷酸化Akt及下游效应分子的表达增强与膀胱癌的进展密切相关。(2)Akt靶向抑制剂MK2206可以抑制肌层浸润性膀胱癌细胞株的侵袭能力,抑制细胞的侵袭能力与侵袭相关蛋白表达水平的降低有紧密关系。(3)Akt靶向抑制剂MK2206联合CDDP可以通过抑制Akt表达及Akt信号通路下游各效应分子的表达水平,来明显增加膀胱癌细胞中顺铂诱导的细胞毒性和凋亡,这种联合治疗为克服膀胱癌的化疗耐药性提供了一种有效的新的治疗思路。