全真一气汤复方多糖对免疫抑制小鼠免疫功能影响初探

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目的1、研究探讨全真一气汤多糖的提取纯化工艺;2、利用环磷酰胺(CY)复制免疫抑制小鼠实验模型,从而为研究全真一气汤多糖的免疫调节作用及其机理创造条件;3、通过观察免疫抑制小鼠整体免疫功能变化及肠道黏膜免疫,探讨全真一气汤复方多糖提高免疫抑制小鼠机体免疫功能的可能机制,进一步阐明全真一气汤复方多糖提高免疫功能的作用靶点,为该方的临床合理应用提供实验基础,为中药复方多糖治疗虚损性疾病提供思路及方法。方法1、以多糖含量为指标,考察脱蛋白、除色素对纯化工艺的影响,并比较超滤法和透析法的优劣;2、健康SPF级BALB/C雄性小鼠20只,随机分为2组①模型组(n=10):腹腔注射环磷酰胺(CY),剂量为100mg/kg,复制肠道免疫抑制模型;②正常对照组(n=10):同样方法注射等量生理盐水。注射后观察对比2组小鼠的饮食、活动、体貌等变化,24H后摘眼球取血处死动物,两组分别摘取小鼠的胸腺和脾脏,称重(mg),分别除以小鼠体重(g),得到胸腺指数和脾脏指数。B.小心取出全小肠,肉眼计数小肠Peyer’s结的数量,观察其形态,从数目和形态两方面对Peyer’s结进行计分。C.全自动血球分析仪检测小鼠外周血白细胞及淋巴细胞数目。根据上述数据对建立的肠道免疫抑制模型进行评价;3、实验造模成功后,另取健康SPF级BALB/C雄性小鼠28只,随机分为4组:①正常对照组(Z)②模型组(M)③QZYQPS灌胃组(GW)④QZYQPS腹腔注射组(ZS)。GW组每天灌胃给予QZYQPS混悬液,剂量为0.75g.kg-1.d-1;ZS组每天腹腔注射QZYQPS(0.25g.kg-1.d-1)。Z、M、ZS组每天灌胃给予灌胃组同体积生理盐水,Z、M、GW组每天注射给予注射组同体积的生理盐水,共10天;4、动物实验分为三部分,第一部分:探讨全真一气汤多糖对免疫抑制小鼠肠道整体免疫功能的影响(包括检测小鼠脏器指数、派氏结计分、外周血白细胞及淋巴细胞计数、血清IL-2浓度、溶血素含量、耳肿胀率);第二部分:采用免疫组化的方法检测胸腺、脾脏、小肠绒毛凋亡基因Bcl-2、Bax的含量;第三部分:采用ELASA法测定肠道SIgA的含量。结果1、经过透析法精制后多糖含量高于超滤法;经脱蛋白工艺处理后,多糖含量略有下降,但脱蛋白后再经过透析法精制,多糖含量有大幅度提升;除色素工艺对多糖含量的影响较小,但除色素后再经过透析法精制,可以得到高纯度的多糖,含量达87.63±0.97%;2、腹腔注射CY及生理盐水后小鼠无一例死亡,正常组小鼠一般情况良好,毛色光亮,对外界刺激反应灵敏;模型组小鼠精神萎靡,毛色枯槁,活动和进食较正常组减少。经CY腹腔注射24小时后的小鼠脏器指数降低,Peyer’s结计分较正常组比较减少,外周血白细胞数目及淋巴细胞数目均明显降低。对比正常组有统计学意义(P<0.05);3、GW组、ZS组的脏器指数、派氏结计分、外周血白细胞数目及淋巴细胞数目均较M组高(P<0.05);GW组、ZS组的血清溶血素含量及IL-2浓度较M组高(P<0.05);GW组、ZS组的耳肿胀率较模型组高(P<0.05),且GW组有优于ZS组的优势;4、GW组、ZS组胸腺、脾脏、小肠绒毛与M组比较抑制凋亡基因Bcl-2含量升高、促凋亡基因Bax的含量减低(P<0.05);GW组、ZS组的肠道SIgA的含量较模型组增加(P<0.05);且GW组均优于ZS组。结论:1、脱蛋白、除色素工艺对于全真一气汤复方多糖精制过程有较大的影响,优化后的最终工艺为:水提→醇沉→酶法脱蛋白→大孔树脂除色素→透析;2、腹腔注射剂量为100mg/kg环磷酰胺(CY)24小时可以成功构建小鼠免疫抑制模型;3、全真一气汤复方多糖可对抗免疫抑制小鼠免疫器官重量、外周血白细胞及淋巴细胞数目的降低,刺激外周血血清IL-2的增加,对体液和细胞免疫功能具有促进作用,同时也提示多糖口服给药免疫活性强于腹腔注射给药;4.QZYQPS口服及注射有对抗环磷酰胺致小鼠免疫器官凋亡的作用,其可能机制是通过提高抗凋亡基因bcl-2和同时降低促凋亡基因bax的表达而实现的。同时,全真一气汤复方多糖灌胃组SIgA分泌量显著增加,口服给药组的效果明显优于腹腔注射组,提示机体肠道黏膜免疫与系统免疫之间存在一定相关性。
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