目的:激素性股骨头坏死（steroid-induced osteonecrosis of the femoral head,SONFH）的具体发病机制,仍不完全清楚,目前尚无确切有效的早期治愈手段。深入研究SONFH的发病机制,对早期防治SONFH具有重要的现实意义。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lnc RNA）可通过调控基因表达,进而参与各种疾病的发生与发展。然而,lnc RNA在SONFH发生与发展中的作用,尚需进一步探索。本课题旨在深入研究Fos相关的长链基因间非编码RNA ENSRNOT00000088059.1（Fos-associated linc RNA ENSRNOT00000088059.1,FAR591）介导骨微血管内皮细胞（bone microvascular endothelial cells,BMECs）凋亡在SONFH发病中的作用和机制,为揭示SONFH的发病机制增加新证据,为其早期防治探索新靶点。方法:1、分离培养大鼠BMECs和成骨细胞（osteoblast,OB）,采用不同浓度氢化可的松（hydrocortisone,HC）诱导BMECs和OB凋亡,比较BMECs和OB对糖皮质激素（glucocorticoid,GC）的敏感性。采用甲泼尼龙（methylprednisolone,MP）建立SD大鼠SONFH模型,在MP用药后不同时间点（2周和4周）,采用免疫荧光染色检测BMECs标志物CD31（cluster of differentiation 31,CD31）和OB标志物OSX（osterix,OSX）的表达水平,CD31免疫荧光染色联合原位末端转移酶标记技术（Td T-mediated d UTP nick-end labeling,TUNEL）检测BMECs凋亡,microfil血管造影检测股骨头微血管体积和血流量,磁共振成像（magnetic resonance imaging,MRI）、微计算机断层扫描（micro-computed tomography,micro-CT）和苏木精-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色检测股骨头坏死。从而研究GC诱导BMECs凋亡在SONFH发生与发展中的作用。2、采用lnc RNA/信使RNA（messenger RNA,m RNA）联合芯片,在不同浓度GC诱导BMECs凋亡的模型中,筛选GC浓度依赖性lnc RNA和m RNA,对差异表达的m RNA进行京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）和基因集富集分析（gene set enrichment analysis,GSEA）,挑选出线粒体凋亡途径的核心基因,通过临近基因筛选和编码/非编码基因共表达（coding/non-coding geneco-expression,CNC）分析,共同锁定与凋亡相关的候选lnc RNA:FAR591。采用互补脱氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid,c DNA）末端快速扩增技术（rapid amplification of c DNA end,RACE）检测FAR591的全长序列,pc DNA4/myc-His表达质粒验证FAR591的蛋白编码能力,RNA-荧光原位杂交技术（RNA-fluorescence in situhybridization,RNA-FISH）检测FAR591的亚细胞定位,实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction,q PCR）验证芯片数据,染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation,Ch IP）技术检测糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor,GR）在FAR591基因启动子上的富集水平。从而筛选和鉴定GC诱导BMECs凋亡相关的lnc RNA:FAR591。3、采用基因转染技术过表达FAR591基因,或采用CRISPR/Cas9技术敲除FAR591基因,然后使用GC诱导BMECs凋亡。采用TUNEL/4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）和Annexin V/碘化丙啶（propidium iodide,PI）检测BMECs凋亡,Western Blot检测细胞死亡调解子（Bcl-2 interacting mediator of cell death,Bim）、P53上调凋亡调节因子（P53 up-regulated modulator of apoptosis,Puma）和活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Cleaved-Caspase3,Cleaved-CASP3）等凋亡相关蛋白的表达。从而研究FAR591在GC诱导BMECs凋亡中的作用。4、采用芯片在过表达或敲除FAR591的BMECs中检测基因表达谱,以筛选FAR591可能调控的下游靶点,然后采用q PCR和Western Blot验证芯片数据。根据芯片的筛选数据和验证结果,证实Fos是FAR591调控的下游靶点。采用基因转染过表达技术或CRISPR/Cas9技术干预BMECs中Fos的表达,然后采用GC诱导BMECs凋亡。通过Western Blot检测Bim、Puma和Cleaved-CASP3等凋亡相关蛋白的表达,TUNEL/DAPI和Annexin V/PI检测BMECs凋亡。从而研究Fos在GC诱导BMECs凋亡中的作用。5、设计阻断实验和挽救实验,首先采用基因转染技术过表达FAR591,然后在过表达FAR591的基础之上,进一步敲除Fos,或首先采用CRISPR/Cas9技术敲除FAR591,然后在敲除FAR591的基础之上,进一步上调Fos,最后采用GC诱导BMECs凋亡。通过Western Blot检测Bim、Puma和Cleaved-CASP3等凋亡相关蛋白的表达,Annexin V/PI检测BMECs凋亡。从而研究FAR591是否通过调控Fos的表达,进而介导GC诱导BMECs凋亡。6、首先证实FAR591对Fos的调控作用是否发生在转录水平。然后根据FAR591全长序列设计特异性寡核苷酸探针,采用RNA纯化的染色质分离技术（chromatin isolation by RNA purification,Ch IRP）结合高通量测序（sequencing,Seq）和质谱分析（mass spectrometry,MS）,筛选FAR591相互作用的顺式作用元件或反式作用因子。采用Ch IRP-PCR和Ch IRP-Western Blot验证FAR591能否与Fos基因启动子和TATA盒结合蛋白相关因子15（TATA-box binding protein associated factor15,TAF15）结合。采用Ch IP检测TAF15和RNA聚合酶II（RNA polymerase II,Pol II）在Fos基因启动子上的结合位点。最后,在过表达或敲除FAR591的基础之上,采用Ch IP检测TAF15和Pol II在Fos基因启动子上的富集水平,q PCR和Western Blot检测Fos表达。从而研究FAR591调控Fos基因表达的机制。7、采用FAR591敲除或过表达腺相关病毒体内转染SD大鼠股骨头BMECs,再采用MP建立大鼠SONFH模型。在MP用药后第4周,采用CD31荧光抗体标记BMECs,然后采用RNAscope和免疫荧光检测BMECs中FAR591、Fos、Bim和Puma的表达,TUNEL染色检测BMECs凋亡,microfil血管造影评估股骨头微血管体积和血流量,免疫荧光染色检测runt相关转录因子2（runt-related transcription factor 2,Runx2）和OSX的表达,MRI、micro-CT和HE染色评估股骨头坏死。从而研究FAR591介导BMECs凋亡在SONFH发生与发展中的作用。结果:1、低浓度HC（0.20mg/m L）即可诱导大量BMECs凋亡并抑制其成管型,而诱导OB凋亡并抑制其成骨则需要更高的HC浓度（0.30mg/m L）,表明BMECs对糖皮质激素更为敏感。采用MP建立SONFH模型,在MP用药后第2周,模型组股骨头组织CD31表达水平下降,CD31+-TUNEL+双阳性细胞率增加,血管造影显示股骨头软骨下微血管体积和血流量减少。但OSX表达水平无明显改变,HE染色、MRI和micro-CT均未见明显的骨坏死征象。在MP用药后第4周,模型组股骨头CD31表达水平持续降低,CD31+-TUNEL+双阳性细胞率进一步增加,血管造影显示股骨头软骨下微血管体积和血流量明显减少。此时,OSX表达水平降低,HE染色可见软骨下骨小梁排列紊乱、变薄、中断,骨小梁周围的成骨细胞消失,可见大量空骨陷窝,MRI检查（T1和T2加权像）可见股骨头软骨下骨坏死的异常信号,micro-CT检查显示股骨头软骨下骨密度（bone mineral density,BMD）、骨体积分数（bone volume fraction,BVF）、骨小梁数量（trabecular number,Tb.N）和骨小梁厚度（trabecular thickness,Tb.Th）等指标降低（P＜0.05）。这些结果表明,GC诱导BMECs凋亡是发生SONFH的前期事件。2、Lnc RNA/m RNA联合芯片在BMECs中检测到GC浓度依赖性lncRNA 104个和GC浓度依赖性m RNA 345个（变化倍数＞2,P＜0.05）;KEGG和GSEA富集分析显示,这些m RNA在凋亡信号通路中被显著富集,且富集在凋亡信号通路中的m RNA主要是线粒体凋亡途径的基因;对线粒体凋亡途径的核心基因进行CNC分析（Pearson相关系数＞0.99,P＜0.01）和临近基因筛选（距离＜200kb）,共同锁定与凋亡相关的候选lnc RNA:FAR591。通过RACE技术检测FAR591全长序列为1041bp。生物信息学分析和pc DNA4/myc-His表达质粒均证实FAR591不能编码蛋白质。RNA-FISH检测FAR591主要定位于细胞核。在GC诱导BMECs凋亡模型中,FAR591随着GC浓度和细胞凋亡率的增加,其表达持续上调。在SONFH组织的BMECs中也检测到FAR591显著高表达。针对GR的Ch IP-seq分析表明,GR可与FAR591基因启动子结合,且GC可提高GR在FAR591基因启动子上的富集水平。这些结果暗示,FAR591与GC诱导的BMECs凋亡有关。3、采用CRISPR/Cas9技术成功敲除BMECs中的FAR591基因,Bim、Puma和Cleaved-CASP3表达下调,BMECs凋亡率明显降低,表明敲除FAR591可有效阻断GC诱导BMECs凋亡。相反,通过基因转染过表达技术在BMECs中成功过表达FAR591,Bim、Puma和Cleaved-CASP3表达上调,BMECs凋亡率明显增加,表明过表达FAR591可显著促进GC诱导BMECs凋亡。这些结果证实,FAR591可介导GC诱导BMECs凋亡。4、采用基因芯片筛选FAR591调控的下游靶点,结果表明,过表达FAR591可上调Fos表达,而敲除FAR591可下调Fos表达。Western Blot验证芯片数据,结果也证实FAR591可调控Fos表达。采用CRISPR/Cas9技术敲除BMECs中的Fos基因,Bim、Puma和Cleaved-CASP3表达下调,可有效阻断GC诱导BMECs凋亡。相反,采用基因转染过表达技术在BMECs中过表达Fos,Bim、Puma和Cleaved-CASP3表达上调,可显著促进GC诱导BMECs凋亡。这些结果表明,Fos作为FAR591的下游调控靶点,可促进GC诱导BMECs凋亡。5、阻断实验和挽救实验结果表明,过表达FAR591,可促进Bim、Puma和Cleaved-CASP3的表达,增加BMECs凋亡率;在过表达FAR591的基础之上,进一步敲除Fos,Bim、Puma和Cleaved-CASP3表达随之下调,BMECs凋亡率下降,表明敲除Fos可阻断FAR591的促凋亡作用。相反,敲除FAR591,可下调Bim、Puma和Cleaved-CASP3的表达,降低BMECs凋亡率;在敲除FAR591的基础之上,进一步上调Fos,Bim、Puma和Cleaved-CASP3表达随之上调,BMECs凋亡率增加,表明过表达Fos可逆转敲除FAR591的结果。这些结果证实,FAR591可通过调控Fos表达,进而介导GC诱导BMECs凋亡。6、FAR591定位于细胞核,过表达或敲除FAR591,Fos在m RNA和蛋白水平的表达量均发生了明显改变,暗示FAR591对Fos的调控作用可能发生在转录水平。Ch IRP-Seq分析表明,FAR591结合的motif序列为AGRGGGYRWDMGGGAS,在基因组中共有80523个差异的富集峰（P＜10-5）,4.35%富集峰位于基因启动子,其中,包括Fos基因启动子。Ch IRP-PCR验证结果也证实FAR591可与Fos基因启动子结合,结合位点在Fos基因转录起始位点（transcription start site,TSS）上游（-245～-51）区。Ch IRP-MS共鉴定到27个与FAR591特异性结合的蛋白质,这些蛋白质与转录激活有关,其中包括TAF15,MS在TAF15中共检测到4条特异性肽段,序列覆盖率为21.20%。Ch IRP-Western Blot验证结果也证实FAR591可与TAF15结合。Ch IP检测结果表明TAF15和Pol II可与Fos基因启动子结合,结合位点在TSS附近（-108～+80）。过表达FAR591可增加TAF15和Pol II向Fos基因启动子富集,进而促进Fos基因表达。敲除FAR591基因可减少TAF15和Pol II向Fos基因启动子富集,进而抑制Fos基因表达。这些结果表明,FAR591可在Fos基因启动子区招募TAF15和Pol II,进而以转录激活作用促进Fos基因表达。7、在股骨头BMECs中敲除FAR591基因,Fos、Bim和Puma表达下调,BMECs凋亡率下降,股骨头微血管体积和血流量增加,Runx2和OSX表达上调,HE染色可见空骨陷窝减少,micro-CT检查可见软骨下骨小梁排列尚规整,BMD、BVF、Tb.N和Tb.Th等指标升高,MRI检查仅见少部分股骨头出现骨坏死的异常信号,SONFH发生率明显降低为12.50%（P＜0.01）。相反,在股骨头BMECs中过表达FAR591,Fos、Bim和Puma表达明显上调,BMECs凋亡率增加,股骨头微血管体积和血流量下降,Runx2和OSX表达下调,HE染色见骨小梁周围成骨细胞完全消失和大量空骨陷窝,micro-CT检查见软骨下骨小梁广泛吸收中断,BMD、BVF、Tb.N和Tb.Th等指标明显降低,MRI检查见大量股骨头出现骨坏死的异常信号,SONFH发生率明显升高为93.33%（P＜0.01）。这些结果证实,FAR591介导GC诱导BMECs凋亡,可导致股骨头微循环障碍,进而促进SONFH的发生与发展。结论:在本研究中,我们首先确定了GC诱导BMECs凋亡是发生SONFH的前期事件。同时,我们在BMECs中鉴定了一个新的lnc RNA,即FAR591,它可响应GR介导的核效应,在BMECs中被GC诱导高表达,进而介导GC诱导BMECs凋亡。在机制上,FAR591可与Fos基因启动子结合,形成稳定的RNA:DNA三联体结构,随后,FAR591在Fos基因启动子区招募TAF15和Pol II,促使转录前起始复合体在Fos基因启动子区形成,进而以转录激活作用促进Fos基因表达,激活Fos/线粒体凋亡途径,导致BMECs凋亡。FAR591介导GC诱导BMECs凋亡,可引起股骨头微循环障碍,进而促进SONFH的发生与发展。