论文部分内容阅读
目的探讨生命早期特别是孕期和哺乳期VD摄入不足对子代雄性小鼠肥胖发生的影响及可能的作用机制。方法采用4周龄SPF级C57BL/6J雌性小鼠30只,随机分为2组,在孕期和哺乳期间分别给予VD含量正常(VD control,VD-C)和VD含量缺乏的(VD deficiency,VD-D)繁殖饲料喂养6周,然后分别与12周龄C57BL/6J雄性小鼠按照2:1进行交配繁殖。待雄性仔鼠断奶后各自分为两组(n=10),分别给予高脂饲料(high-fat diets,HFD)和普通饲料喂养,即为VD正常高脂饲料组(VD-C-HFD)、VD缺乏高脂饲料组(VD-D-HFD)、VD正常普通饲料组(VD-C)、VD缺乏普通饲料组(VD-D)。进行如下指标检测:1.每周监测小鼠体重、进食量和能量摄入2.口服葡萄糖耐受试验(Oral glucose tolerance test,OGTT)喂养至第13周,小鼠禁食10小时后,检测空腹血糖,随后给予葡萄糖(2.0g/kg)灌胃处理,连续监测小鼠第15、30、60、90及120分钟尾尖血糖。3.胰岛素耐量试验(Insulin tolerance test,ITT)喂养至第14周,小鼠禁食2小时后,检测空腹血糖,随后给予腹腔注射胰岛素(2IU/kg),连续监测小鼠第15、30、60、90及120分钟尾尖血糖。4.小鼠血清脂肪代谢指标的检测喂养至16周后收集各组小鼠血清,利用生化试剂盒检测钙离子(Ca)、25(OH)D3、甘油三酯(Triglyceride,TG)及总胆固醇(Total cholesterol,TC)浓度。5.检测性腺周围脂肪组织(epididymal white adipose tissue,e WAT)和皮下脂肪组织(inguinal white adipose tissue,i WAT)的改变喂养至16周后,获取各组小鼠e WAT和i WAT,进行称重;组织病理学检测e WAT及i WAT,HE染色比较脂肪细胞体积大小;免疫组化法检测脂肪组织巨噬细胞的浸润;流式细胞术测定e WAT及i WAT组织M1型脂肪组织巨噬细胞(M1 adipose tissue macrophage,M1 ATM,CD45~+CD64~+CD11C~+)、M2型脂肪组织巨噬细胞(M2 adipose tissue macrophage,M2 ATM,CD45~+CD64~+CD11C~-)、DC细胞(adipose tissue dendritic cells,ATDCs,CD45~+CD64~-CD11C~+)、CD4~+T淋巴细胞(CD45~+CD3~+CD4~+)及CD8~+T淋巴细胞(CD45~+CD3~+CD8~+)的比例改变。定量实时聚合酶链式反应(Quantitative real time polymerase chain reaction q-PCR)检测e WAT及i WAT脂肪组织中促炎因子(i NOS、IL-1β、TNF-α、INF-γ及IL-6)及抑炎因子(Arg-1、IL-4及IL-10)的表达水平。ELISA检测血清中促炎因子(TNF-α及INF-γ)及抑炎因子(IL-4及IL-10)的表达水平。结果在正常饲料喂养组(VD-D vs VD-C),VD-D组小鼠体重、皮下脂肪、性腺脂肪重量及脂肪细胞体积均显著高于VD-C组(P<0.05),而在高脂饲料喂养肥胖组(VD-D-HFD vs VD-C-HFD),VD-D-HFD组小鼠体重增长、皮下脂肪、性腺脂肪重量及脂肪细胞的体积也显著高于VD-C-HFD组(P<0.05)。OGTT试验结果显示,孕期及哺乳期VD缺乏可使子代雄性肥胖(VD-D-HFD vs VD-C-HFD,VD-D vs VD-C)、体内血糖及曲线下面积显著升高(P<0.05);ITT试验结果显示,注射胰岛素后各组小鼠体内血糖水平变化无统计学差异;胰岛素免疫组化结果提示,孕期及哺乳期VD缺乏可使子代(VD-D-HFD vs VD-C-HFD,VD-D vs VD-C)胰腺组织中胰岛素阳性细胞数量显著减少(P<0.05),且胰岛素分泌量显著降低(P<0.05)。各组小鼠血清脂肪代谢指标结果显示,在正常饲料小鼠中(VD-D vs VD-C),VD-D组小鼠血浆TG水平显著高于VD-C组(P<0.05),血浆TC、Ca、25(OH)VD及随机血糖均无统计学差异;而在肥胖组小鼠中(VD-D-HFD vs VD-C-HFD),VD-D-HFD组小鼠血浆TG及TC水平显著高于VD-C-HFD组(P<0.05),但血浆Ca、25(OH)VD及随机血糖在两组中无统计学差异。在eWAT中,孕期及哺乳期VD缺乏使子代雄鼠脂肪中(VD-D-HFD vs VD-C-HFD,VD-D vs VD-C)F4/80阳性巨噬细胞数量显著增多(P<0.05)。流式细胞术结果显示,肥胖组小鼠与正常组小鼠相比,肥胖组小鼠e WAT中M1ATMs、ATDCs、CD4~+T细胞、CD8~+T细胞数量及M1/M2比值均显著增加,M2ATM数量及M2/M1比值则显著降低(P<0.05),CD4~+T/CD8~+T细胞比值无统计学差异;i WAT中M1ATMs、M2ATMs、ATDCs、CD4~+T细胞数量及M1/M2、CD4~+/CD8~+T细胞比值均显著增加(P<0.05)。在高脂饲料喂养的肥胖组小鼠中(VD-D-HFD vs VD-C-HFD),VD-D-HFD组小鼠e WAT中M1ATMs、ATDCs数量及M1/M2比值增加,M2/M1比值降低(P<0.05),i WAT中ATDCs数量、CD4~+/CD8~+T细胞比值增加(P<0.05);在正常饲料喂养的小鼠中(VD-D vs VD-C),VD-D组小鼠e WAT中M1ATMs、ATDCs数量及M1/M2比值增加,M2/M1比值均显著降低(P<0.05),i WAT中,M1ATMs、M2ATMs、ATDCs、CD4~+T细胞、CD8~+T细胞数量及M1/M2的比值增加(P<0.05)。q-PCR结果显示,与VD-C组相比,VD-D小鼠e WAT及i WAT组织中促炎因子(i NOS、IL-1β、TNF-α、INF-γ及IL-6)及抑炎因子(IL-4及IL-10)的表达均增高,Arg-1表达降低(P<0.05);在肥胖组小鼠中(VD-D-HFD vs VD-C-HFD),e WAT中促炎因子(i NOS、IL-1β、TNF-α、INF-γ及IL-6)表达上调,抑炎因子(Arg-1、IL-4及IL-10)表达降低(P<0.05),i WAT中INF-γ表达上调,Arg-1表达降低(P<0.05)。ELISA检测各组小鼠血清炎性因子结果显示,与正常小鼠(VD-D及VD-C)相比较,肥胖组小鼠(VD-D-HFD及VD-C-HFD)血清中促炎性因子(TNF-α及INF-γ)表达增高(P<0.05),而抑炎因子(IL-4及IL-10)表达降低(P<0.05);同时孕期及哺乳期VD缺乏可使子代雄性肥胖(VD-D-HFD vs VD-C-HFD)及正常小鼠(VD-D vs VD-C)血浆中TNF-α或INF-γ表达增高,IL-4及IL-10的表达降低(P<0.05)。结论孕期及哺乳期VD缺乏可通过调节免疫细胞招募及极化,进而促进脂肪组织炎性因子的分泌加重子代雄鼠肥胖的发生。