【摘 要】
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目的:神经元蜡样脂褐质沉积症(neuronal ceroid lipofuscinoses,NCLs)是一组人类进行性神经元变性疾病,多为常染色体隐性遗传。基本特征为溶酶体内蜡样脂褐质沉积。主要分为N
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目的:神经元蜡样脂褐质沉积症(neuronal ceroid lipofuscinoses,NCLs)是一组人类进行性神经元变性疾病,多为常染色体隐性遗传。基本特征为溶酶体内蜡样脂褐质沉积。主要分为NCL1～NCL10 10型,CLN8为NCL8的致病基因,其功能及其在发病机制中的作用尚不清楚。本研究首先建立酵母双杂交系统,再应用该系统从人胎脑文库中筛选CLN8P相互作用蛋白质,并对候选蛋白进行初步鉴定分析。通过对相互作用蛋白质的筛选及研究,探讨CLN8的功能,为NCL8和NCLs疾病群的发病机制研究提供线索,并为疾病的蛋白质相互作用网络提供资料。 方法:1)以SV40大T抗原和P53蛋白的相互作用为阳性对照建立酵母双杂交系统;2)将CLN8编码区序列克隆至MATCHMAKER LexA酵母双杂交系统pLexA质粒,构建诱饵(bait)—pLexA-CLN8,再将pLexA-CLN8质粒转染酵母菌株EGY48(p80p-LacZ),建立EGY48(p80p-LacZ)-pLexA-CLN8融合菌株,检测其毒性和自激活性;3)以pLexA-CLN8为诱饵质粒,应用序列转化法筛选人胎脑cDNA文库,得到Leu+LacZ+阳性克隆,并用酶切鉴定其外源性片断:4)应用共转化法将获得的阳性质粒与诱饵质粒一对一重新转入酵母菌内,对相互作用进行验证;5)对验证后的阳性克隆的外源性片断进行测序及同源性分析。 结果:1)建立了酵母双杂交检测系统;2)构建了酵母表达质粒pLexA-CLN8及EGY48(p80p-LacZ)-pLexA-CLN8融合菌株,并通过检测证实CLN8P对酵母细胞无毒性、无自激活性;3)以构建好的EGY48(p80p-LacZ)-pLexA-CLN8融合菌作“诱饵”,从人胎脑cDNA文库中筛选得到60个Leu+LacZ+阳性克隆。提取质粒扩增后酶切鉴定,获得有外源性片断的质粒45个;4)将获得的具有外源性片段的文库质粒与诱饵质粒一对一重新转入酵母体内,对相互作用进行验证,共获得阳性克隆22个;5)对验证后阳性克隆测序并进行同源性分析,共获得不同的候选基因序列10个。 结论:1)在本实验室建立了酵母双杂交系统,并且在建立酵母双杂交系统过程中,分析了影响酵母转化效率的因素,以及怎样尽量减少假阳性率的发生,为本实验室酵母双杂交技术平台的建立提供了经验;2)构建了pLeXA-CLN8
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