【摘 要】
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目的:观察小鼠不同发育阶段植入前胚中Snail mRNA表达与蛋白变化,运用RNA干扰（RNAi）技术特异性敲低Snail表达水平,研究Snail在小鼠植入前胚发育过程中的作用,并进一步探讨Snail与合子基因组激活的关系。方法:1.分别收集KM雌性小鼠和雄性小鼠（♀KM×♂KM）合笼所得各发育阶段植入前胚。运用免疫荧光（IF）检测技术,检测SNAIL蛋白在其中的定位情况;2.获取KM雌性小鼠受精
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目【81671526】; 福建省科技创新联合资金项目【2017Y9114】; 福建省自然科学基金面上项目【2018J01728】
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目的:观察小鼠不同发育阶段植入前胚中Snail mRNA表达与蛋白变化,运用RNA干扰（RNAi）技术特异性敲低Snail表达水平,研究Snail在小鼠植入前胚发育过程中的作用,并进一步探讨Snail与合子基因组激活的关系。方法:1.分别收集KM雌性小鼠和雄性小鼠（♀KM×♂KM）合笼所得各发育阶段植入前胚。运用免疫荧光（IF）检测技术,检测SNAIL蛋白在其中的定位情况;2.获取KM雌性小鼠受精前后发育至不同阶段的植入前胚,用Real-Time PCR技术检测Snail mRNA的表达情况。3.收集KM小鼠1-细胞胚（hCG后27h）,选取具有明显双原核的1-细胞胚,运用显微注射技术,将Snail-siRNA导入1-细胞胚中,随后于KSOM培养液中继续培养。（1）观察Snail-siRNA注射后的植入前胚发育情况;（2）于hCG后48h,分别收集KSOM对照组、阴性对照组、Snail-siRNA注射组的体外发育2-细胞胚,运用Real-Time PCR技术检测Snail、Trps1及合子基因组激活相关基因eIF1A mRNA表达水平。4.运用IF检测技术,观察人正常卵巢上皮细胞系（IOSE-80）内SNAIL蛋白的定位;5.运用Snail-siRNA敲低技术,将Snail-siRNA导入IOSE-80细胞系中,收集经Snail-siRNA转染24h的细胞,运用Real-Time PCR技术检测Snail与Trps1 mRNA的表达情况。结果:1.IF检测结果显示,SNAIL蛋白从卵母细胞到囊胚阶段的卵裂球中都有分布,在2-细胞胚后期到桑葚胚前期定位于细胞核中,在桑葚胚后期至囊胚期主要定位于胞质。2.Real-Time PCR技术检测结果显示,Snail mRNA在1-细胞胚时期表达最高,随后逐渐降低。3.培养结果显示,与KSOM对照组、阴性对照组相比,Snail-siRNA注射组囊胚过渡率明显降低（P<0.001）,约1/3的植入前胚被抑制在4-细胞胚之前（P<0.001）;Real-Time PCR结果显示,注射Snail-siRNA后,2-细胞胚Snail mRNA水平显著低于KSOM对照组和阴性对照组（P<0.01）,而eIF1A mRNA水平显著上升（P<0.01）,与此同时,Trps1 mRNA水平明显升高（P<0.001）。4.SNAIL蛋白在IOSE-80细胞系中核质均表达,主要表达在细胞核中,与植入前胚定位相类似。5.IOSE-80细胞系中Snail mRNA敲低后,Trps1 mRNA表达水平明显升高（P<0.001）。结论:运用IF和Real-Time PCR技术对不同发育阶段小鼠植入前胚进行分析,提示Snail可能参与植入前胚合子基因组激活。1-细胞胚显微注射Snail-siRNA后发现,Snail主要影响合子基因组激活和母型向合子型过渡的过程。敲低Snail mRNA表达水平后,2-细胞胚内eIF1A及Trps1 mRNA表达水平明显上调,提示Snail可能通过影响eIF1A和Trps1的转录,参与合子基因组激活的过程。与此同时,在人正常卵巢上皮细胞IOSE-80中,敲低Snail mRNA后,Trps1 mRNA表达水平明显上调,进一步证实Snail可能参与调控Trps1的转录功能。
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