论文部分内容阅读
以茶树1005品系为研究对象,应用PCR、RACE技术及在线生物信息学分析软件,首次克隆并分析了茶树酯型儿茶素合成前体物质之一GA的生物合成途径中aroB、aroDE基因的全长cDNA序列。结合对茶树1005品系不同叶位酯型儿茶素含量的测定结果,选择叶位为处理因素,并根据得到的aroB、aroDE序列设计特异引物,应用荧光定量技术测定了aroB与aroDE基因在茶树1005品系不同叶位的表达差异。1茶树1005品系不同叶位酯型儿茶素含量茶树1005品系酯型儿茶素总量变化范围为6.71%～22.49%,一叶最高,老叶最低,其含量随叶位次序的增加而显著减少,含量高低次序为：一叶>芽>二叶>三叶>四叶>五叶>六叶>老叶。EGCG含量,在同一叶位中极显著高于其他3种酯型儿茶素单体,在不同叶位中的含量变化范围为2.26%～13.09%,其含量亦基本随叶位次序的增加而显著减少。整体上,顺式酯型儿茶素含量极显著高于反式儿茶素。2茶树aroB基因的全长cDNA克隆及生物信息学分析应用RACE技术,从茶树1005品系顶芽首次克隆获得aroB基因的全长cDNA序列,命名为Cs1005-aroB, NCBI GeneBank登录号为KM009084。Cs1005-aroB cDNA序列全长1509bp,其中ORF序列长1350bp,3’UTR序列长89bp, 5’UTR序列长70bp。Cs1005-aroB蛋白生物学信息经在线软件预测分析,显示：Cs1005-aroB蛋白为亲水性非分泌蛋白,稳定性高,保守性强,三维结构与中华猕猴桃aroB基因高度相似,亲缘关系与欧洲山毛榉较近,具有DHQS特征结构域。推测Cs1005-aroB蛋白在叶绿体中合成,与其结合起激活作用的金属离子为Fe2+。3茶树aroDE基因的全长cDNA克隆及生物信息学分析应用RACE技术,从茶树1005品系顶芽克隆获得3条aroDE基因的全长cDNA序列,分别命名为Cs1005-aroDE1、Cs1005-aroDE2、Cs1005-aroDE3, NCBI GeneBank登录号分别为KM009085、KM009086、KM009087。基因Cs1005-aroDE1全长2118bp,编码519个氨基酸；Cs1005-aroDE2全长1990bp,编码532个氨基酸；Cs1005-aroDE3全长1957bp,编码525个氨基酸。3条aroDE基因同源性为64.32%,共同相似区域分布不连续,所编码的氨基酸序列同源性为65.36%,共同相似区域分布亦不连续。Cs1005-aroDE1、Cs1005-aroDE2与Cs1005-aroDE3三条蛋白序列的生物学信息经在线软件预测分析,显示：三种蛋白均为亲水性非分泌酸性蛋白,稳定性高；虽序列结构相似性不高,但三种蛋白的空间结构高度相似,均与拟南芥aroDE基因高度相似；三种蛋白磷酸化位点均较多；三种蛋白各自保守性都较强,均具有DHQase_I、Shikimate_dh_N及 NAD_bind_Shikimate_DH功能域,且蛋白Cs1005-aroDE2多出一个莽草酸结合位点；Cs1005-aroDE1蛋白合成与发挥作用的场所最可能在细胞质中,而Cs1005-aroDE2与Cs1005-aroDE3蛋白合成与发挥作用的场所最可能在线粒体中；三种蛋白均各自与葡萄相应类型的aroDE蛋白亲缘关系较近,但彼此间亲缘关系相对较远。4茶树1005品系不同叶位aroB与aroDE基因的定量表达分析应用2-ΔΔCt法计算的SYBR Green荧光定量法检测了Cs1005-aroB、 Cs1005-aroDE1、Cs1005-aroDE2与Cs1005-aroDE3四个基因在茶树1005品系不同叶位的相对表达量。四基因在不同叶位的表达量均呈现近似正态分布的趋势,除Cs1005-aroDE3在第二叶表达量最高外,其余三基因均在第三叶检测到最高表达量。与3条aroDE基因显著不同,aroB基因在顶芽表达量最低。