研究内容和目的1.采用微波辅助提取技术从虎杖中提取白藜芦醇，得到最佳提取工艺，做初步鉴定。2.体外观察白藜芦醇标准品抑制肝癌细胞株HepG-2细胞生长的作用，明确量效关系，选择药物的半数抑制浓度为后期进行白藜芦醇抗肝癌机制研究做参考。3.为开发利用虎杖资源提供科学的实验依据。4.探讨白藜芦醇抗肿瘤作用的机制，为临床应用提供理论依据。研究方法1.对虎杖中白藜芦醇采用微波辅助提取的方法，以对照品为指标，利用紫外分光光度仪测定白藜芦醇吸光度进行指标控制，采用L9（34）正交实验设计法筛选最佳提取工艺。2.倒置显微镜下观察不同浓度的白藜芦醇作用于人肝癌HepG-2细胞后的形态学变化。3.采用hoechest33342荧光染色法观察不同浓度的白藜芦醇（100μmo/L,50μmol/L,25μmol/L,12.5μmol/L）作用于人的肝癌HepG-2细胞48h后细胞形态变化。4.应用噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法测定不同浓度的白藜芦醇（100μmo/L,50μmol/L,25μmol/L,12.5μmol/L）作用不同时间（24h，48h，72h）后对人肝癌HepG-2细胞的生长抑制作用。5.不同浓度（100μmo/L,50μmol/L,25μmol/L,12.5μmol/L）的白藜芦醇作用于肝癌HepG-2细胞48h后，流式细胞术检测其对细胞周期的影响。研究结果1.微波辅助萃取技术提取虎杖中白藜芦醇的最佳工艺为：微波功率100W，温度25℃，微波时间30min，物料比例1：20。该工艺下的白藜芦醇提取率为91%，优于传统的水浴提取法。2.在倒置显微镜下可见，阴性对照组人肝癌HepG-2细胞呈梭形，形态饱满，成片排列，胞质丰富分布均匀，细胞核大；阳性对照组（顺铂5μg/L）细胞结构不清，胞核碎裂，溶解，固缩。大量死细胞漂浮于细胞悬液中。各实验组细胞经过白藜芦醇处理后，可观察到细胞排列紊乱，轮廓不规则，细胞膜皱缩、变圆、脱落，细胞内胞质分布不均匀，细胞体积变小，贴壁细胞数量变少。3.hoechest33342荧光染色观察，对照组肝癌HepG-2细胞细胞膜完整，细胞核形态饱满，核质染色均一，着色较浅；HepG-2细胞经过白藜芦醇处理48h后观察可见，细胞膜发生皱缩，细胞核相对变小，荧光增强明显，细胞核染色质发生浓集并碎裂呈圆形的细胞碎片，此即为凋亡小体，表现典型的凋亡形态特征。4.MTT结果显示，白藜芦醇对人肝癌HepG-2细胞的生长有抑制作用。该作用有剂量依赖性和时间依赖性。25μmol/l,50μmol/l,100μmol/l组的抑制作用与对照组相比较,差异具有统计学意义，（P<0.05）。实验组在24小时后，低浓度组12.5μmol/l对肝癌HepG-2细胞的抑制作用不明显（P>0.05）。48小时后，四个浓度组12.5μmol/l，25μmol/l,50μmol/l,100μmol/l均对肝癌细胞有抑制作用，差异具有高度的统计学意义，（P<0.01）。抑制率分别为48.68%,32.56%,11.17%,9.80%。72h后四个浓度25μmol/l,50μmol/l,100μmol/l均对肝癌细胞有抑制作用，差异具有高度的统计学意义，（P<0.01）。抑制率分别为58.75%，35.73%，16.46%，14.68%。5.流式细胞术检测白藜芦醇作用于HEPG-2细胞48h后，流式细胞仪分析发现，阴性对照组的细胞主要处于G0/G1期。随着白藜芦醇处理浓度的增大，G0/G1期则逐渐降低，而S期比率逐渐增大。100μmol/l，50μmol/l组S期比例分别高达77.50%，65.21%，极显著高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。25μmol/l,12.5μmol/l组S期比例达到65.21%，54.00%，与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。研究结论1.微波辅助提取技术与传统提取方法相比，安全，环保，节能，高效，提取率高。为天然产物活性成分的分离纯化开辟了一条新途径。为白藜芦醇大规模生产提供了技术支持。2.白藜芦醇作用于人肝癌HepG-2细胞后，细胞形态发生改变。3.白藜芦醇对人肝癌HepG-2细胞具有明显的生长抑制作用，且抑制作用呈时间依赖性和剂量依赖性。4.白藜芦醇对人肝癌HepG-2细胞具有促凋亡作用，且随着处理浓度的增大，凋亡细胞的数量逐渐增加。5.白藜芦醇作用于人肝癌HepG-2细胞后，细胞阻滞于S期。