前列腺癌是西方国家男性生殖系统最常见的恶性肿瘤。在美国，前列腺癌占男性恶性肿瘤发病率的首位和死亡率的第二位，仅次于肺癌。随着老年人口数量的增长和诊断水平的提高，我国前列腺癌占住院病人的比例也逐年增加，严重威胁中老年男性的健康、生命和生活质量。现在许多医疗工作者正致力于前列腺癌防治的研究，并提出了许多防治前列腺癌的新方法。2003年一项为期7年有18882人参加的临床试验表明用于治疗前列腺增生症的2型5α还原酶抑制剂非那雄胺能够抑制前列腺癌的发生，显示了非那雄胺用于前列腺癌防治的巨大潜力。我们采用基因芯片研究了非那雄胺作用前后前列腺癌LNCaP细胞的基因表达变化，筛选出了一些与非那雄胺的抑癌作用有密切关系的基因，其中有同源框基因NKX3．1，肿瘤抑制基因PTEN等(发表于中华医学杂志2005年21期)。有研究表明同源框基因NKX3．1在前列腺癌的发生发展中具有重要作用，NKX3．1的丢失与前列腺癌的癌前病变一一前列腺上皮内瘤变(P工N)有密切关系。 为了进一步明确NKX3．1在前列腺癌中的重要作用，我们采用目前研究基因功能的最有力的RNA干扰技术使前列腺癌细胞LNCaP中的NKX3．1表达下调，观察NKX3．1表达下调对LNCaP细胞的影响，为NKX3．1作为有前途的前列腺癌肿瘤标志物和基因治疗的靶点提供理论依据。 目的: 构建针对NKX3．1的短发卡RNA(shRNA)质粒载体，观察其介导LNCaP细胞中NKX3．1表达下调以及对细胞增殖生长、细胞周期、侵袭转移能力的影响和对LNCaP细胞基质金属蛋白酶2(matrixmetalloproteinase，MMP2)表达的影响。材料与方法 根据专利算法设计了两条能够编码NKX3．1shRNA的寡核苷酸单链以及一条编码阴性shRNA的寡核苷酸单链，与pRNAT～U6．1／Neo质粒进行重组，并行双酶切鉴定及DNA测序。随后重组质粒转染雄激素敏感性前列腺癌细胞系LNCaP，在不同时间点采用RT一PCR和westernblot在NKX3．1mRNA和蛋白质水平检测。进一步筛选NKX3．1表达缺失的LNCaP单克隆细胞。比较NKX3．1表达缺失前后前列腺癌细胞LNCaP的增殖能力、细胞形态、细胞周期、侵袭力的改变以及细胞侵袭相关基因MMP2表达的变化。 结果: 酶切鉴定与DNA测序显示重组质粒中含有所设计的寡核苷酸单链，序列正确。转染阴性shRNA-N质粒的LNCaP细胞中NKX3．1的表达未受影响(p>0．05)，而转染NKX3．1shRNA-l和NKX3．1shRNA-2的LNCaP细胞中NKX3．1mRNA和蛋白质表达水平显著下降(p<0．05)，其中转染NKX3．1shRNA-2的LNCaP细胞NKX3．1表达下调更明显。转染NKX3．1shRNA-2的LNCaP增殖生长与两对照组细胞相比增殖生长明显加快(p<0．05)。经过新霉素筛选4周后获得了NKX3．1表达缺失的LNCaP细胞亚系并命名为LNCaP(一NKX3．1)。LNCaP(一NKX3．1)细胞细胞周期S期比例明显升高，但未观察到明显的形态学变化。侵袭小室试验显示LNCaP(一NKX3．1)细胞侵袭能力明显增高(p<0．05)，进一步检测MMP2表达在mRNA和蛋白质水平均升高。 结论: 成功重组了编码NKX3．1shRNA的质粒载体，重组质粒能够使NKX3．1基因在mRNA和蛋白质水平表达下调。制备了NKX3．1表达缺失的LNCaP(一NKX3．1)细胞亚系，NKX3．1表达下调能够促进肿瘤细胞进入S期而生长加快。NKX3．1表达缺失能够增加LNCaP细胞的MMP2的表达而增加细胞的侵袭转移能力。