目的:世界卫生组织癌症研究中心2002年的统计,我国胃癌发病率全球居第二位。胃癌(Gastric carcinoma)患者多数就诊时已是晚期,失去手术机会,且胃癌异质性强,所以胃癌预后差,已成为全球第2大肿瘤死因。目前晚期胃癌缺乏标准化的治疗,化疗成为主要治疗方法,然而化疗的疗效已经达到瓶颈,联合分子靶向药物可以提高客观缓解率,然而化疗联合分子靶向药物的用药时序尚无明确定论。尤其是抗血管生成药物在临床应用以较成熟。贝伐珠单抗(Bevacizumab)是一种重组的人源化单克隆抗体,主要是通过选择性与人血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)结合,抑制VEGF下游通路,从而通过抑制内皮细胞增生和新生血管形成来延缓肿瘤的生长和转移。与化疗药物联用时,可以通过改变肿瘤血管的微环境、血管内皮细胞及血管生成,增加肿瘤内药物浓度,达到增敏的效果。本课题旨在研究贝伐珠单抗(Bevacizumab)联合FP方案(氟尿嘧啶(5-Fluorouracil)加顺铂(Cisplatin))化疗方案不同给药时序对荧光酶基因标记的胃腺癌(MGC-803)细胞祼鼠模型肿瘤生长的影响,为临床上贝伐单抗联合FP方案(氟尿嘧啶5-Fluorouracil加顺铂Cisplatin))给药时序提供理论依据。方法:1细胞培养及裸鼠模型的建立对荧光酶基因标记的胃腺癌(MGC-803)细胞进行传代培养,收集对数生长期的荧光酶基因标记的胃腺癌(MGC-803)细胞,调整细胞浓度为2.5×107个/m L,每只BALB/c裸鼠左侧肋腹部皮下接种0.2 m L,制作裸鼠胃腺癌模型。2随机分组25只裸鼠随机分为5组,每组5只。A组为空白对照组(生理盐水)、B组为贝伐珠单抗(Bevacizumab)组(Bev:4mg/kg/d,d1、4每3天腹腔注药21天)、C组为贝伐珠单抗给药前24h给予FP方案(5-FU:20mg/Kg DDP:1 mg/kg d1、4每3天腹腔给药,Bev:4mg/Kg d2、5每3天腹腔给药;21天)、D组为贝伐珠单抗给药同时给予FP方案(Bev:4mg/Kg、5-FU:20mg/Kg、DDP:1 mg/kg d1、4,每3天腹腔给药,21天)、E组为贝伐珠单抗给药后24h应用FP方案(Bev:4mg/Kg d1、4每3天腹腔给药;5-FU:20mg/Kg DDP:1 mg/kg d2、5每三天腹腔给药,21天)。3抑瘤结果评定为动态观察移植肿瘤的生长情况,利用荧光活体成像系统对其进行活体光学成像,记录肿瘤体积及荧光值(测量基线值后每隔7天间断测量)。游标卡尺进行测量肿瘤的长径和短径(测量基线值后每隔2天间断测量),用药结束后,采用吸入水合氯醛处死小鼠,根据LI%=(对照组肿瘤质量-治疗组肿瘤质量)/(空白组肿瘤质量)*100%计算抑瘤率。4病理组织技术首先通过HE染色确定为胃腺癌组织,通过免疫组化的方法确定VEGF-A、MVD及Bax在肿瘤组织的表达情况。5统计方法肿瘤体积、荧光值、抑瘤率、VEGF-A、MVD和Bax符合正态性分布,MVD、Bax、VEGF-A釆用单因素方差分析(One-way ANOVA),LSD进行两两比较。裸鼠体积及荧光值,采取重复测量设计资料的方差分析、多个样本均数比较的方差分析,以P<0.05为有统计学差异。结果:1成瘤率接种7天后,25只裸鼠左侧肋腹部均可触及0.8cm左右的肿瘤。成瘤率:100%。2肿瘤体积及荧光值的变化2.1肿瘤体积(cm3)基线值及治疗后变化(Fig.1):药物处理前移植瘤体积,A组:(0.122±0.021)cm3、B组:(0.119±0.020)cm3、C组:(0.114±0.027)cm3、D组:(0.115±0.011)cm3、E组:(0.116±0.024)cm3,各组间未见显著统计学差异(P=0.975)。在3-21天测量过程中,对d8、d15、d22所得数据进行连续测量分析:对照组较治疗组均存在统计学差异(P值<0.01);联合用药组较单药组存在统计学差异(P<0.01);E移植瘤体积与C、D组有明显统计学差异(P<0.001)。C、D组未见统计学差异(P>0.05)。(Fig.4)2.2肿瘤荧光值基线值及治疗后变化肿瘤荧光值基线值A组:(57784±2145)p/sec、B组:(60354±2422)p/sec、C组:(58335±1956)p/sec、D组:(59425±2145)p/sec、E组:(58778±2011)p/sec,各组间未见显著统计学差异(P=0.843)。在7-22天治疗过程中,对d8、d15、d22所得数据进行连续测量分析:对照组较治疗组均存在统计学差异(P值<0.01);联合用药组较单药组存在统计学差异(P<0.001);E荧光值与C、D组有明显统计学差异(P<0.001);C、D组未见统计学差异(P>0.05)(Fig.3)。病理学验证:治疗过程中第1-14天,各组肿瘤体积和荧光值均逐渐增大,第15-21天,联合用药组肿瘤体积变化不明显,荧光值下降。获得瘤组织后,经HE染色证实存在大片坏死瘤组织(Fig.2)。3瘤体重量及抑瘤率结果A:(1.840±0.041)g、B:(1.503±0.042)g、C:(1.207±0.051)g、D:(1.159±0.112)g、E:(0.986±0.123)g,相较于对照组,B、C、D、E组的抑瘤率分别为18.31%,34.4%、37.01%及46%(Fig.8)。单因素方差分析示存在组间差异(P<0.001)。两两比较:单药组抑瘤率均低于联合治疗组(P<0.01);联合用药组中:E组抑瘤率显著高于C、D组。C、D组未见明显统计学差异(P=0.342)(Table1)。4免疫组化结果分析4.1 VEGF-A(Fig.5)表达率(%)A:91.15±3.30;B:60.19±4.30C:48.15±3.20,D:46.15±3.60;E:33.15±3.81;单因素方差分析示存在组间差异(P<0.05),两两比较:对照组VEGF-A表达率显著高于治疗组(P<0.01);单药组VEGF-A表达率显著高于联合治疗组(P<0.01);联合用药组中:E组显著低于C、D组(P<0.01)。C、D组未见明显统计学差异(P=0.732)。4.2 MVD(Fig.7)分别为A:13.8±1.32;B:7.9±1.23;C:6.4±1.28;D:6.5±1.24;E:4.0±1.20。单因素方差分析示存在组间差异(P<0.05),两两比较:对照组MVD显著高于治疗组(P<0.01);单药组显著高于联合治疗组(P<0.01);联合用药组中:E组MVD显著低于C、D(P<0.01)。C、D组未见明显统计学差异(P=0.843)。4.3 Bax(Fig.6)的表达率LI为:A:45.51±4.67%;B:60.26±4.48%;C:72.35±5.3%4;D:75.24±2.95%;E:90.26±2.53%。单因素方差分析示存在组间差异(P<0.05),两两比较:对照组显著低于治疗组(P<0.01);单药组Bax的表达率显著低于联合治疗组(P<0.01);联合用药组中:E组显著高于C、D组(P<0.01)。C、D组未见明显统计学差异(P=0.754)。结论:1应用贝伐单抗24h后给予FP方案对抑瘤作用优于同时给药组及贝伐单抗24h前给予FP方案治疗组。2贝伐单抗24h后给予FP方案抑瘤作用较其他联合方式抑瘤率高,可能是进一步降低了VEGFA,减少了新生血管生成,并增加了BAX表达。3在抗血管生成药物应用中,肿瘤体积可能并不能真实表现肿瘤对药物的反应。