白地霉脂肪酶在酿酒酵母和毕赤酵母细胞表面的展示研究

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微生物脂肪酶具有底物选择性广、反应条件温和、在有机反应体系中稳定性好、副反应和副产物少等优点,是目前市场上应用最广泛的生物催化剂之一。但游离脂肪酶成本高、难以回收利用,而用传统的方法进行固定化的脂肪酶纯化操作复杂、回收较困难,这些缺点均限制了脂肪酶在工业中的大规模应用。为解决这些问题,本文以白地霉脂肪酶为研究对象,选择酿酒酵母细胞壁蛋白a凝集素为锚定蛋白,分别采用酿酒酵母和毕赤酵母两种真核表面展示系统对其进行表面展示,得到了稳定性提高、生产成本相对低廉的白地霉脂肪酶全细胞催化剂。在此基础上,研究了酵母表面展示白地霉脂肪酶的酶学性质,并筛选优良的全细胞催化剂用于催化鱼油水解富集DHA和EPA,为其大规模工业化应用奠定基础。本文的主要研究工作和创新点如下:(1)首次以N-末端锚定在酿酒酵母细胞壁上的a凝集素为锚定蛋白,将白地霉脂肪酶GCL展示在酿酒酵母EBY100细胞表面。表面展示的GCL对水解pNPC的酶活力为43.7±0.5U/g干细胞,但无法水解橄榄油,推测其可能原因是展示效率不高或酿酒酵母的过糖基化修饰造成酶蛋白的活性中心被遮蔽。酿酒酵母表面展示GCL的最适反应温度和pH分别为40°C和8.5,热稳定性较游离酶有较大的提高,在40°C水浴中温浴3h后残余活力为85%。(2)以酿酒酵母细胞壁蛋白a凝集素为锚定蛋白,成功构建了新的毕赤酵母表面展示载体pPICZXFa。将白地霉脂肪酶基因克隆到该载体中得到pPICZXFa-△GCL,用BstX I线性化后电转入毕赤酵母X-33中,得到重组菌株X-33/pPICZXFa-△GCL。通过摇瓶发酵筛选到一株展示酶活力最高的5#重组子,并对其发酵培养基和条件进行了优化。在甲醇添加量为1%(v/v),接种量为4%(v/v),初始pH7.0的条件下,表面展示的GCL不仅能水解橄榄油且其酶活力由最初的180.2±4.45U/g干细胞提高到273±2.4U/g干细胞。(3)分别以pNPC和橄榄油为底物,考察了毕赤酵母表面展示的GCL水解对硝基苯酚酯和甘油三酯的最适反应温度和pH、热稳定性等酶学性质,评价其应用价值。以pNPC为底物时,其最适反应温度和pH分别为40°C和9.0,在40°C水浴中温浴6h后,残余酶活力为80%;以橄榄油为底物时,其最适反应温度和pH分别为45°C和7.5,在45°C水浴中温浴4h后,残余酶活力为80%。(4)首次利用固定化在毕赤酵母细胞表面的GCL催化鱼油水解,探索其作为全细胞催化剂富集DHA和EPA的工业应用潜能。结果表明:其催化水解鱼油反应14h后,水解度达到最大值28.6%,此时EPA和DHA含量分别为1.85%和30.86%,与原始鱼油相比分别提高了1.21倍和1.29倍,富集后的DHA和EPA总得率为46.62%。
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