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禾本科植物种子(水稻和小麦)是人类食物的主要来源,典型的种子包括胚,胚乳和种皮三部分。谷类的胚乳占种子重量的80%以上。胚乳是三倍体,由2份的母本基因组和1份父本基因组组成,为胚发育和种子萌发提供营养。本研究以二倍体水稻和多倍体小麦两个研究体系,分别研究了水稻父母本胚乳基因组互作和小麦亚基因组间互作调控胚乳发育和基因表达的分子机制。1.水稻父母本胚乳基因组互作调控胚乳发育和基因表达的分子机制遗传印记是由父母本基因组的表达不平衡导致的。印记基因表现为只表达母本(或父本)的等位基因,另一亲本的等位基因沉默。植物中,印记主要发生在胚乳中,但是其分子机制及印记基因对种子发育的调控并不十分清楚。本研究利用二倍体籼稻品种龙特甫和粳稻品种02428正反交胚乳,进行转录组、小RNA和DNA甲基化测序,发掘水稻印记基因及印记非编码RNA和甲基化位点,研究水稻基因印记的分子机制和印记基因对种子发育的调控作用。1)水稻胚乳印记基因鉴定:对两水稻亲本进行重测序分析,鉴定了 2,118,832个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)位点。正反交的两个生物学重复中80%以上的转录本来自于母本等位基因,这些基因为母本印记基因(maternally expressed genes,MEGs),70%以上的转录本来自于父本等位基因为父本印记基因(paternally expressed genes,PEGs),鉴定了 162个MEG和94个PEG基因。PEG不仅在胚乳中表达,在其他组织中也呈现高的表达水平,而MEG主要在胚乳和种子中表达。2)印记的差异甲基化区域分析:为了解DNA甲基化和基因印记的关系,对授粉后7天的水稻杂交种胚乳进行了全基因组甲基化测序,发现了 18,382个CG,861个CHG(H=A,T,或C)和20个CHH iDMR位点,在正反交中大多数位点为母本低甲基化。胚乳中印记基因的甲基化水平显著低于幼苗的。正反交中,印记基因的母本等位基因的甲基化水平显著的低于父本等位基因,这与前人的报道相同。3)微小的反向重复转座元件(miniature inverted-repeat transposable elements,MITE)通过父母本差异甲基化调控MEG和PEG基因的表达:发现77.8%的MEG和83%PEG基因在转录区或上下游2kb区域含有MITE元件,而全基因组中只有59%的基因含有MITE元件;两亲本多态性的MITE在印记基因的3’和5’端显著富集,MITE元件的母本基因组去甲基化激活MEG基因表达;含有MITE元件的印记基因较非印迹基因进化更快,说明MITE元件与印记基因共进化。4)胚乳中非编码RNA(non-coding RNAs,ncRNA)的亲本起源效应:对正反交及两亲本授粉后7天的胚乳进行了小RNA测序,发现了 27个母本表达的(maternally expressed siRNA loci,MESRL)和 29 个父本表达(paternally expressed siRNA loci,PESRL)的小RNA位点。首次在MEG基因中发现了母本表达的21-nt的小RNA;发现印记表达的长链非编码RNA(long non-coding RNAs,lncRNA)分布在印记基因的上游调控区域,与印记基因由相同的亲本等位基因转录。暗示这些表观遗传激活的21-nt的小干扰RNA和lncRNA对印记和种子发育具有重要的调控作用。5)印记基因分布在水稻粒重的数量性状位点中(quantitative trait loci,QTL),调控种子发育:发现58个(35%)MEG和44个(47%)PEG基因位于粒重数量性状位点QTL区域。在本研究中,通过等位特异性表达分析,发现前人鉴定的调控淀粉积累、储藏蛋白合成及影响籽粒灌浆的基因,均是印记表达的。2.小麦亚基因组间互作调控胚乳发育和基因表达的分子机制小麦的种子发育除受到遗传印记的影响,异源多倍体引起的杂种优势及亚基因组间的互作对其发育具有重要作用。Kerber将异源四倍体小麦(AABB)和普通小麦杂交获得非整倍体(AABBD),非整倍体又与普通小麦连续回交9代,并从中选择整倍体材料,这样AABB亚基因组从六倍体小麦中抽提出来,并与普通小麦的AB亚基因组具有99.8%的一致性,形成抽提的异源四倍体小麦(extracted tetraploid wheat,ETW)。ETW在序列上可以代表六倍体中的AABB组分,所以“抽提”四倍体是研究小麦进化和亚基因组互做非常好的材料。本研究利用抽提四倍体小麦(extracted tetraploid wheat,ETW),硬粒小麦(Triticum turgidum,AABB),粗山羊草(Aegilops tauschii,DD)和重合成异源六倍体小麦(AABBDD)的胚乳,进行转录组和小RNA的测序,研究不同亚基因组对小麦种子发育的调控作用。1)普通小麦AB亚基因组的转录谱在异源六倍体化和人工驯化后发生改变:抽提小麦(ETW)表现出多方面的发育异常表型,如植株矮化,穗子变小,籽粒皱缩。本研究鉴定了 ETW与硬粒小麦差异表达基因,其中10,286个ETW下调表达的基因主要调控胚珠发育、DNA甲基化、蔗糖生物合成过程和有丝分裂,11,217个ETW上调表达的基因主要调控程序性细胞死亡和非生物胁迫响应。实时定量RT-PCR结果验证了 RNA测序分析结果。2)AB和D基因组的部分同源基因表达:发现45%-50%的AB和D基因组的基因是部分同源的,78%的部分同源基因加性表达。3)AB和D基因组部分同源基因的互作维持基因组和基因表达的稳定性:发现多数的D拷贝相对于其亲本DD上调表达,而AB拷贝相对于ETW下调表达。在这些上调的D和下调的ETW等位基因中,一半的是部分同源基因。这些同源基因对加性表达,调控蛋白转运、信号转导、GTP结合、细胞内稳态和种子形态发育。4)胚乳中高表达的基因调控种子发育:大量小麦胚乳高表达的基因与水稻调控种子发育基因同源。在重合成异源六倍体小麦中,大量调控种子发育基因都是D等位基因高表达的。这些基因参与细胞分裂、胚乳发育、支链淀粉生物合成、糊粉层发育、遗传印记和能量储存等生物学过程。本研究建立了水稻和小麦种子发育过程中的基因表达和遗传印记模型,研究了多倍体亚基因组间互作和表达偏移对物种进化及种子发育的作用,为禾本科植物育种及提高产量提供了理论基础。