一、研究背景慢性肾脏病(CKD)患者肾功能逐渐减退,通常伴随大量代谢产物的蓄积,其中有多种物质具有生物活性,影响机体及细胞的功能,其表现我们称之为尿毒症症状,而引起这些症状的相关物质称其为尿毒症毒素。欧洲尿毒症毒素工作组(EUTox)将目前已证实的尿毒症毒素建立了数据库(EUTox Database),截止2012年共计有146种尿毒症毒素。对于CKD患者,肾脏无法彻底清除潴留的尿毒症毒素,故需要肾脏替代治疗包括肾移植,血液透析及腹膜透析(PD)发挥清除作用。迄今为止,仍有诸多研究者致力于识别更多的尿毒症毒素,并证实其作用机制。通常我们将尿毒症毒素根据分子大小,水溶性或脂溶性,是否能被透析清除等特性分为三大类:(1)小分子水溶性毒素,分子量<500Da,如肌酐、尿素氮等;(2)蛋白结合毒素(PBUT),分子量通常<500Da;(3)中分子毒素,通常包括一些小分子多肽。也有按照产生部位的分类方法,如肠源性或非肠源性毒素。而PBUT指大部分为与蛋白结合的小分子毒素,如硫酸吲哚酚(IS)、硫酸对甲酚(PCS),也包括少量蛋白结合的中分子毒素,且PBUT多在肠道内产生。目前已知的PBUT总计10大类,32种。随着研究的深入,越来越多的证据表明,PBUT直接或间接地对心、脑、肾等重要脏器造成严重损害。通过文献检索,选用超高效液相色谱/质谱-电喷雾电离串联(UHPLC-ESI-MS/MS)技术,拟对包括硫酸吲哚酚(Indoxyl sulfate,IS),马尿酸(Hippuric acid,HA),对羟基马尿酸(p-hydroxyhippuric acid,p-OH HA),犬尿喹啉酸(Kynurenic acid,KYNA),3-羧-4-甲-5-丙基呋喃戊酮酸(3-carboxy-4-methyl-5-propyl-2-furanpropionic acid,CMPF)等进行检测及探讨,证实上述研究对象在PD患者中血清浓度异常,探讨可能影响PBUT浓度的相关因素,最后对患者进行随访,探究PBUT是否会影响PD患者长期预后。二、研究目的本试验研究主要分为三部分,研究目的为:1.证实健康志愿者、CKD4-5期未透析患者及PD患者三类人群PBUT(IS、HA、p-OH HA、KYNA、CMPF)浓度差异;2.在腹膜透析患者中,对血清PBUT影响因素进行分析;3.探究蛋白结合毒素对PD患者长期预后的影响。通过以上研究,明确肾功能不全的患者可导致蛋白结合毒素在体内的蓄积,拟探究对血清蛋白结合毒素浓度的影响因素,并探讨PBUT对腹膜透析患者长期预后的影响。三、研究方法(一)健康志愿者、CKD4-5期未透析患者及PD患者三类人群血清蛋白结合毒素浓度差异招募海军军医大学上海长征医院腹透中心2016年1月至2016年12月期间符合入选标准PD患者(n=50),性别比例男:女=1:1,排除年龄大于75岁或小于18岁,腹膜透析维持时长小于1个月,合并血液透析患者,1月内发生腹膜炎或合并其他感染性疾病,处于自身免疫性疾病活动期,合并恶性肿瘤,近1月内发生心血管事件的患者。收集同时间段至长征医院肾内科住院诊治,病情稳定的慢性肾脏病患者(n=50)(根据EPI公式计算eGFR值),收集两类患者血清标本,测定血清蛋白结合毒素浓度。同时至长征医院体检中心招募50例健康志愿者,收集血清标本按上述方法处理作为对照组。三组研究对象均签署知情同意书。本临床试验已通过海军军医大学上海长征医院生物医学研究伦理委员会审批,批件编号2014SL027。选择超高效液相色谱/质谱-电喷雾电离串联(UHPLC-ESI-MS/MS)技术同时检测样本血清中7种PBUT的浓度。分析三组人群血清PBUT浓度差异。计量资料以均数±标准差(?x±SD),中位数(第一四分位数,第三四分位数)表示,选用SPSS 21.0软件进行统计分析,三组计量数据服从正态分布并方差齐性的前提下,组间两两比较采用LSD-t检验,不满足上述条件的,选用Kruskal-Wallis H检验检验,组间两两比较采用nemenyi法检验。计数资料采用频数描述,计数资料组间比较采用Fisher确切概率检验。P<0.05为差异有统计学意义。(二)腹膜透析患者多种血清蛋白结合毒素影响因素分析2016年1月至2017年7月,招募上海长征医院腹透中心符合入选条件的PD患者进行研究。研究对象是慢性肾衰竭维持性腹膜透析治疗的患者,排除年龄小于18岁或超过75岁,要求腹透维持时间超过1个月,不合并血液透析治疗。同时排除有慢性自身免疫性疾病活动期或活动性感染;哺乳期或妊娠期;合并晚期恶性肿瘤;既往1个月内发生过心脑血管事件的患者。所有参与研究的患者均要求签署知情同意书。收集患者各项临床资料,血检验结果等。收集血清标本,采用UHPLC-ESI-MS/MS法检测血清标本中IS、HA、p-OH HA、KYNA、CMPF浓度,分析血清PBUT浓度与性别、残余肾功能、小分子毒素、腹透充分性、腹膜转运性质,营养及炎症指标CRP等之间的关系。计量资料以均数±标准差(?x±SD),中位数(第一四分位数,第三四分位数)表示,选用SPSS 21.0软件进行统计分析,对于未满足双变量正态分布的数据,单因素相关性分析采用Spearman等级相关,多因素分析采用多重线性回归分析方法。P<0.05为有统计学意义。(三)蛋白结合毒素影响腹膜透析患者预后的队列研究按上述第二部分纳入、排除标准,招募PD患者242人,按上述要求留取患者血清标本,行PBUT浓度检测。按PBUT浓度水平分为高浓度及低浓度两组,并对其进行随访。设定终点事件为发生心脑血管事件,腹透相关性腹膜炎。研究终点时间为2018年2月10日,时间度量单位为天。采用SPSS 21.0软件行Kaplan-Meier检验,绘制生存曲线。两组生存曲线比较行Log-rank检验。检验水准(?)为0.05,P<0.05差异有统计学差异。四、结果(一)健康志愿者、CKD4-5期未透析患者及PD患者三类人群血清蛋白结合毒素浓度差异健康志愿者年龄54.38±8.95岁,慢性肾脏病患者年龄58.22±10.30岁,PD患者年龄为55.14±13.09岁。三组之间年龄无统计学差异。健康志愿者组:IS170.88(79.17,398.06)ng/ml,HA 101.19(52.99,266.68)ng/ml,p-OH HA5.94(0.00,36.72)ng/ml,KYNA 1.15(0.00,4.34)ng/ml,CMPF 166.05(119.53,279.37)ng/ml;CKD患者:IS 7922.58(2650.39,14589.39)ng/ml,HA 1163.51(363.17,3200.91)ng/ml,p-OH HA 222.47(100.43,714.56)ng/ml,KYNA 75.04(36.48,180.32)ng/ml,CMPF1789.04(803.39,3557.57)ng/ml;PD患者:IS 26554.56(7282.30,55338.06)ng/ml,HA4203.98(1350.10,17691.15)ng/ml,p-OH HA 1730.12(478.52,3695.43)ng/ml,KYNA252.16(134.12,444.34)ng/ml,CMPF 730.14(390.81,1448.12)ng/ml。健康志愿者分别与CKD患者及PD患者比较血清PBUT浓度,有统计学差异。CKD患者及PD患者,比较IS、HA、p-OH HA、KYNA血清浓度,P<0.05,差异有统计学意义。(二)腹膜透析患者多种血清蛋白结合毒素影响因素分析共有122例PD患者入组,年龄48.61±15.24岁,其中女性42例(34.4%),透析龄18.53±26.99个月。PD患者血清IS 21371.31(10875.88,46991.80)ng/mL,HA4049.45(1350.10,16299.32)ng/mL,p-OH HA 1607.74(657.72,3319.72)ng/mL,KYNA257.41(137.74,466.40)ng/mL,CMPF 845.30(376.78,1588.37)ng/mL。血清IS与透析龄、腹膜Kt/V、腹膜Ccr、BUN、Scr、P、CaP乘积正相关,与总Kt/V、残肾Kt/V、总Ccr、残肾Ccr、残肾eGFR、AST、Na、HDL呈负相关。血清HA与透析龄、腹膜Kt/V、腹膜Ccr、BUN、Scr、K、P、CaP乘积正相关,与总Kt/V、残肾Kt/V、总Ccr、残肾Ccr、残肾eGFR、Hb、ALT、AST、Na呈负相关。血清p-OH HA与透析龄、腹膜Kt/V、腹膜Ccr、BUN、Scr、P、CaP乘积正相关,与总Kt/V、残肾Kt/V、总Ccr、残肾Ccr、残肾eGFR、AST、Na、HDL呈负相关。血清KYNA与透析龄、腹膜Kt/V、腹膜Ccr、BUN、Scr、P、CaP乘积正相关,与年龄、总Kt/V、残肾Kt/V、总Ccr、残肾Ccr、残肾eGFR、ALB、AST、TC呈负相关。血清CMPF与ALB、BUN、K、P、CaP乘积正相关,与Na呈负相关。以上PBUT均与WBC、PLT、CRP、Glu、UA、Ca、PTH、TG之间无明显相关性。(三)蛋白结合毒素影响腹膜透析患者预后的队列研究PD患者平均生存时间为450.31±272.22天。KYNA:以心脑血管事件及腹膜炎为终点事件,高浓度组与低浓度组生存曲线无统计学差异(P=0.100),以心脑血管事件为终点事件,两组生存曲线无统计学差异(P=0.059),以腹膜炎为终点事件,两组生存曲线无明显差异(P=0.817)。HA:以心脑血管事件及腹膜炎为终点事件,高浓度组与低浓度组生存曲无明显差异(P=0.268),以心脑血管事件为终点事件,两组生存曲线无统计学差异(P=0.345),以腹膜炎为终点事件,两组生存曲线无明显差异(P=0.720)。其余IS、p-OH HA、CMPF两组间生存曲线无统计学差异。五、结论1.肾功能异常患者血清蛋白结合毒素明显高于健康志愿者。同时PD患者的血清多种蛋白结合毒素与慢性肾功能不全未透析患者比较,浓度存在差异,考虑腹膜透析对PBUT浓度有影响。2.蛋白结合毒素IS、HA、p-OH HA、KYNA与小分子毒素(BUN、Scr)、磷代谢指标(P、CaP乘积)呈正相关,与残肾功能(Kt/V、Ccr、eGFR)、总Kt/V、总Ccr呈负相关。而与WBC、PLT,CRP,Ca、PTH等指标无相关性。而蛋白结合毒素CMPF与腹膜功能、残肾功能无相关性。以上数据提示PBUT主要依靠残肾功能清除,腹膜具有部分清除能力,保护残肾功能有利于PD患者清除血清PBUT。3.蛋白结合毒素IS、HA、p-OH HA、KYNA对PD患者长期预后无影响。