论文部分内容阅读
背景:诱导多能干细胞(iPS)是一种极具应用前景的多能干细胞,和胚胎干细胞相似,能够在体内外分化成各种成体细胞,是一种理想的治疗心肌梗死的种子细胞,然而在缺血心肌组织中低下的存活率却限制了其应用。因此,我们合成出一种全新的可注射的基于叶酸的小分子水凝胶,并包裹iPS细胞进行移植治疗心肌梗死。目的:叶酸多肽水凝胶包裹iPS治疗心肌梗死并其评价效果,探讨叶酸多肽水凝胶作为可注射支架材料的可能,为iPS临床进一步应用提供实验依据。方法和结果:1.使用固相合成法合成了基于叶酸的多肽分子FA-FFFRGDssEE,并检测了其成胶性能。使用流变仪检测其形成水凝胶的流变性质,透射电镜观察其微观形貌;活-死细胞染色及CCK-8法检测其生物相容性;心肌组织注射检测水凝胶的体内降解性。结果显示,FA-FFFRGDssEE可以形成性能良好的水凝胶,并具备良好的生物相容性。2.以不依赖饲养层的方法培养iPS细胞,并以EB(拟胚体)法诱导iPS向心肌细胞分化。以qPCR方法检测分化第0,3,5,7,11,15天OCT3/4,MESP1,ISL-1,GATA4,MYH6,cTnT,vWF基因的表达变化。结果显示,细胞的多能性标志物,中胚层标志物,祖细胞标志物,心肌细胞及内皮细胞标志物的表达均随时间规律变化,符合胚胎发育的进程。分化的细胞中可以看到MYH6/cTnT和vWF染色阳性的细胞。随后用CCK-8检测了 iPS细胞在叶酸水凝胶(1.0 wt%,0.75 wt%,0.5 wt%)中的增殖,用活-死细胞染色观察了 iPS细胞在水凝胶中的存活。结果显示:iPS细胞在各个浓度叶酸水凝胶中的增殖和存活良好,无明显差别。我们选取了力学强度最高的叶酸水凝胶(1.0wt%)进行后续实验。以qPCR和免疫荧光检测了 iPS在l.Owt%叶酸水凝胶上的分化,结果显示:iPS能在1.0Wt%叶酸水凝胶上正常分化为心肌细胞和内皮细胞。我们又用流式细胞计数检测了氧化应激条件下,iPS在叶酸水凝胶中的凋亡情况。结果显示:叶酸水凝胶明显降低了 iPS在氧化应激中的凋亡率。3.叶酸多肽水凝胶包裹iPS对小鼠心肌梗死进行了移植治疗,实验分为5组:Sham 组,PBS 组,FAhydrogel 组,iPS 组,FAhydrogel+iPS 组。心梗后 28 天行心脏超声示:FA hydrogel+iPS组的心功能改善最明显。Masson染色示:FA hydrogel +iPS组心脏纤维化程度最小。免疫荧光示:FA hydrogel +iPS组的iPS细胞存活率更高。MYH6荧光染色示:iPS在小鼠心脏内继续分化为心肌细胞。vWF荧光染色示:FA hydrogel +iPS组梗死区的血管密度更高。Isolectin B4染色示:FAhydrogel+iPS组梗死周边区毛细血管密度更高。WGA染色示:FA hydrogel +iPS组心梗周边区心肌细胞肥大程度最小。心梗区和周边区组织qPCR结果示:FA hydrogel +iPS组VEGF和bFGF基因上调最多。结论:1.成功合成了基于叶酸的多肽分子FA-FFFRGDssEE,该多肽能自组装形成稳定透明的水凝胶,具有良好的生物相容性,体内可降解,具备作为心肌组织工程可注射支架材料的条件。2.成功以iPS诱导分化出心肌细胞和内皮细胞,且叶酸多肽水凝胶能够很好地容纳iPS的增殖,存活及分化,并能提高iPS细胞抗氧化损伤的能力。3.叶酸水凝胶联合iPS移植有效改善了心梗小鼠的心功能,抑制了心室重构,增加了 iPS的滞留率,促进新生血管形成。