一、研究目的急性白血病是血液系统常见恶性肿瘤,病死率极高,时至今日,化疗仍是绝大多数急性白血病患者的主要甚至唯一治疗方法。伴随着新药的研发,化疗方案及支持治疗的进步,病人预后较前已大为改观。目前急性淋巴细胞白血病患者接受强力化疗后约有80-90%可以达到完全缓解。然而,单纯化疗能够维持长期缓解的机率较低,超过60%的病人在缓解后不久便会出现疾病的复发。此时患者体内的白血病细胞耐药性常常会显著增强,对于药物治疗反应不佳,疾病进展加快,同时机体对于再次化疗的耐受性差,正常造血恢复不佳,最后往往由于造血衰竭或治疗引起的感染、出血等相关事件而死亡。很久以来,研究者就认识到,微小残留病是白血病复发的根源[4],因此加强白血病微小残留病阶段的研究,了解白血病化疗后完全缓解至复发过程中白血病细胞所发生的各种变化,对于急性白血病的治疗意义重大。与此同时,正如前文所述,复发白血病患者再次接受化疗后往往会出现造血恢复延迟或不全,提示白血病化疗缓解后复发患者体内的正常造血可能已经受到一定程度的损伤。这些大大阻碍着临床白血病患者治疗的进步,严重影响着广大人民的健康。因此针对白血病复发患者体内正常造血的研究,对于明确再次化疗后造血恢复不佳的原因,进而改善患者对于再次治疗的耐受性具有重大的临床指导价值。造血干细胞是机体正常造血系统所有血细胞的来源,具有自我更新、多向分化及长期造血重建功能。在骨髓微环境中这些细胞的增殖、分化受到严格调控,以维持机体的造血稳态。当机体面临感染、肿瘤等病理状况时,造血系统会发生改变。既往研究发现急性白血病模型小鼠骨髓造血干/祖细胞尽管数目明显降低,但造血干细胞的比例较正常对照升高,同时保有正常的造血重建功能。在临床实践中我们观察到急性白血病病人的正常造血功能低下,尤其是疾病复发后造血衰竭加速,这些复发病人再次接受化疗后往往会表现出造血恢复不佳,可能其体内造血干／祖细胞的造血重建功能受到损伤,提示复发白血病患者体内造血干／祖细胞发生了不同于单纯白血病机体的改变,然而目前我们对于这一改变还知之甚少。基于以上认识,在本研究中,我们利用非照射性急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)小鼠模型,给予该模型小鼠阿糖胞苷及环磷酰胺联合化疗,构建小鼠急性白血病化疗缓解至复发模型,并进一步利用流式细胞术、造血集落培养及竞争性骨髓移植实验等研究该模型中造血干／祖细胞及白血病细胞的变化规律与机制。二、材料方法(一)实验小鼠、细胞白血病细胞受体及正常对照小鼠：8周雌性C57/BL6J(CD45.2+)小鼠；竞争性骨髓移植受体小鼠及竞争性细胞来源：8周雌性B6.SJL(CD45.1+)小鼠。急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)细胞：由天津血液病研究所程涛教授课题组馈赠,通过诱导B6.SJL小鼠骨髓Lin-细胞过表达Notch-1 ICN.GFP产生,本实验中所用T-ALL细胞为该细胞经小鼠体内传代至第五代时所冻存的白血病发病小鼠的脾脏细胞。(二)化疗药物及最大可耐受剂量(MTD)的确定化疗药物：阿糖胞苷(Ara-C;Actavis Italy S.P.A,通用名“注射用阿糖胞苷”,商品名“赛德萨”,粉剂,100mg/支)和环磷酰胺(CTX；江苏恒瑞医药股份有限公司,通用名“环磷酰胺注射剂”,商品名“环磷酰胺”,粉剂,200mg/支)。药物溶于无菌PBS中,浓度为50mg/ml,置于-20℃冰箱避光保存。MTD实验：每组待测试小鼠5只,腹腔连续给药4天,后续监测7天,以不引起小鼠死亡且小鼠体重下降<10%的最大剂量作为MTD。测试所得Ara-C与CTX的MTD分别为150mg/kg与100mg/kg。(三)非照射性T-ALL小鼠化疗模型的建立给予正常C57/BL6J小鼠经尾静脉注射T-ALL细胞(105/只),注射后第11天经腹腔给予前述化疗药物处理。通过调整化疗药物的剂量和(或)化疗疗程,建立疗程&剂量依赖性的急性白血病化疗小鼠模型,其后检测不同处理下小鼠体内白血病细胞与骨髓造血干／祖细胞的变化。(四)细胞流式免疫表型检测及细胞流式分选分析小鼠骨髓造血细胞时所用免疫表型如下：造血干细胞(HSC;Lin-c-Kit+Sca-1+; LKS+),其亚群包括长周期造血干细胞(LT-HSC;LKS+Flk2-CD34-),短周期造血干细胞(ST-HSC;LKS+Flk2-CD34+)及多能造血祖细胞(MPP;LKS+Flk2+CD34+);造血祖细胞(HPC;Lin-c-Kit+Sca-1-;LKS-),其亚群包括髓系共同祖细胞(CMP; LKS’CD 16/32lowCD34+),粒系巨噬系祖细胞(GMP;LKS-CD16/32highCD34+)及巨核系红系祖细胞(MEP;LKS-CD16/32lowCD34-)。造血细胞与白血病细胞通过GFP及CD45.1、CD45.2分子的表达来进行区分,造血细胞为GFP-CD45.1-CD45.2+,白血病细胞为GFP+CD45.1+CD45.2-。进行小鼠骨髓造血干细胞(LKS+)分选时,首先利用c-Kit(CD117)磁珠进行骨髓c-Kit阳性细胞的富集,其后按照上述细胞表型进行流式抗体的标记,继之进行流式细胞分选；白血病细胞的分选通过GFP分子的表达进行；细胞进行流式分选前加入DAPI去除死细胞。(五)细胞凋亡的检测使用FITC-Annexin-V联合7-AAD标记。已完成细胞表型染色的细胞离心弃净上清后每107的细胞中加入200u1凋亡试剂盒(BD PharmigenTM FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit)所带staining buffer,及两种染料(均加入5ul/ml),37℃避光孵育15分钟,其后每管再次加入300ul staining buffer,1小时内送检流式。(六)细胞周期的检测通过Ki-67及Hoechst33342联合标记来进行。已完成细胞表型染色的细胞破膜后每107的细胞中加入5ul PE-Ki-67 (BD Bioscience),37℃避光孵育30分钟,流式上机检测前每管中加入Hoechst 33342 (5ug/ml; Invitrogen)。(七)细胞衰老的检测细胞衰老状况使用ImaGene GreenTM C12FDG lacZ Gene Expression Kit (Molecular Probes, Inc.)进行标记,其后应用流式细胞术检测衰老相关的β-半乳糖苷酶底物C12-FDG的表达强度(FITC通道)。(八)体外造血集落形成实验无菌条件下应用流式细胞术分选小鼠骨髓造血细胞(CD45.2+)进行体外造血集落形成实验。分选所得细胞离心后调整细胞浓度至1.2x106/m1,吸取50u1加入3m1M3434培养基中,混匀后铺于24孔板,每孔加入细胞混悬液0.5m1(由细胞悬液及培养基混匀所得,因细胞悬液相对培养基体积少,可忽略,换算后每孔细胞数视为10000个/孔)。每组五个复孔,置于37℃,5%C02,湿度≥95%的培养箱中培养。培养十天后倒置显微镜下计数各系造血集落数目。(九)竞争性骨髓移植实验骨髓移植受体小鼠接受致死剂量照射后(总剂量9.5Gy,分为2次给予照射,间隔4小时),经尾静脉注射给予流式细胞术分选所得待测试细胞(分别为白血病一天大剂量化疗组小鼠化疗后第1、2、5及12天的骨髓造血细胞,CD45.2+)及竞争性骨髓造血细胞(正常B6.SJL对照小鼠骨髓造血细胞,CD45.1+)各5x105/鼠(照射结束6小时后24小时内)。移植后一个月开始应用流式细胞术检测小鼠尾血中待测试细胞(CD45.2+)的嵌合率及各系分化状况,其后每月一次,总计监测四个月。(十)基因表达水平的检测流式分选所得细胞利用RNA nano-prep kit提取RNA,反转录成cDNA作为qRT-PCR模板。qRT-PCR实验所用仪器为实时定量PCR仪(ABI-7500),使用SYBR-G reen mix法进行。具体实验参数设置及所有引物序列详见各部分序列附表。(十一)统计分析如无特殊说明,所有数据均以平均值±标准误表示；生存状况利用Kaplan-Meie r log-rank法进行分析,两组计量资料的比较采用Student-t检验进行分析,多组资料采用One-way ANOVE进行分析,续以Dunnett法比较各组间差异,比较前进行方差齐性检验。P-0.05时,差异视为具有统计学意义。三、结果(一)非照射性小鼠急性T淋巴细胞白血病模型的建立接受白血病细胞注射组小鼠100%发生T-ALL,其生存期明显缩短,注射后中位生存时间为29天(21～35天),而正常对照在长达40天的观察期内未发生死亡,差异具有显著的统计学意义(P=0.0001)。检测小鼠外周血血常规,结果示：白血病小鼠随时间逐渐出现外周血白细胞增高,尤以淋巴细胞为主(白细胞计数x103/u1;+7d9.48±3.35,+10d 11.05±2.19,+14d 16.35±3.74,+18d 26.40±4.96,+21d 23.93±5.90;淋巴细胞比例%：+7d 80.48±4.38,+10d 77.78±4.71,+14d 79.90±6.34,+18d 97.10±0.52,+21d 95.53±0.34),贫血(血红蛋白g/L-+7d 140.30±2.66,+10d 148.50±1.19,+14d 125.50±6.31,+18d 133.00±3.67,+21d 93.25±10.06)及血小板减少(血小板计数x104/uh+7d 124.00±53.46,+10d 111.60±10.04,+14d 55.95±6.73,+18d 22.20±3.18,+21d 12.80±1.38)。小鼠骨髓中白血病负荷亦从注射后第七天开始逐日上升(第12天增长至10%左右)。注射后第21天处死濒死小鼠进行组织病理学检测(H&E染色),在小鼠骨髓、肝脏及脾脏中可见大量白血病细胞浸润,应用流式细胞术检测小鼠骨髓及外周血中白血病细胞的免疫表型,结果显示两者一致,其免疫表型为CD45.1+GFP+CD3+CD4+CD8+,提示为T-ALL,伴有GFP及CD45.1的表达。(二)化疗剂量&疗程依赖性的小鼠急性白血病化疗模型白血病细胞注射后第12天给予不同剂量(大剂量组为Ara-C 150mg/kg+CTX 100mg/kg;小剂量组为Ara-C 75mg/kg+CTX 50mg/kg)及疗程(大剂量组包含连续化疗1、2、3及4天组)的阿糖胞苷联合环磷酰胺化疗,发现所有化疗组小鼠的中位生存期均较未接受化疗处理的单纯白血病组有所延长：单纯白血病组29天(27～35天),一天小剂量化疗组33(29～43)天,大剂量化疗1、2、3天组分别为39.5(30～59)45(31～63)及71.5(44-90)天,90天的监测期中一天大剂量4天组仅有1只死于化疗药物腹腔注射损伤),伴随化疗疗程延长或化疗剂量加大,小鼠急性白血病化疗缓解后无复发时间明显延长(小剂量一天化疗组为10天,大剂量1、2及3天组分别为14、17及26天,大剂量4天化疗组90天内未见复发),与此同时对于正常造血的抑制也更重、更持久。(三)微小残留病阴性的完全缓解至复发小鼠白血病化疗模型接受白血病细胞注射的小鼠在注射后第11天给予阿糖胞苷(150mg/kg)联合环磷酰胺(100mg/kg)一天腹腔给药治疗。化疗后第2至5天小鼠外周血及骨髓中的白血病细胞负荷接近或低于可检测水平的下限(阈值设为0.01%),同时该时间段内小鼠外周血血小板计数与正常对照进行统计学分析未见明显差异(P值均>0.05)。我们将这一阶段定义为化疗后白血病MRD阴性的CR时期,其后小鼠体内白血病细胞逐渐上升直至复发,该组小鼠白血病细胞注射后的中位生存时间为39.5(30～59)天。(四)微小残留病阳性的完全缓解至复发小鼠白血病化疗模型小鼠接受白血病细胞注射后第11天给予阿糖胞苷(75mg/kg)联合环磷酰胺(50mg/kg)一天腹腔给药治疗。化疗后小鼠外周血及骨髓中白血病细胞均迅速减低,化疗后第2天达到谷底,此时小鼠骨髓中白血病细胞比例为0.05%(>0.01%),之后逐渐上升直至复发,该组小鼠白血病细胞注射后的中位生存时间为33(29-43)天。(五)化疗后造血干／祖细胞频数增加早于白血病细胞,同时出现造血祖细胞分化的GMP偏移及长周期造血干细胞比例的降低急性白血病化疗后MRD阴性CR至复发模型中,骨髓CD45.2+LKS及CD45.2+LKS+造血细胞均于化疗后第2天即开始增加[前者x10：1532±271.4(d1)：4298±286.6(d2)；后者x100：229±64.74(d1)；1038±52.82(d2)],至化疗后第5天达到高峰[前者x10：15217±2243(d5)；后者x100：15075±2118(d5)],其后白血病复发,CD45.2+LKS-/LKS+数目开始逐渐下降[前者x10：1825±458.1(d12);后者x100：1270±367.7(d12)]；白血病细胞在化疗后迅速降低,自第二天始持续低于检测下限,第5天再次检测到,其后逐步上升至疾病复发。从化疗后第2天即造血开始恢复阶段起进行造血祖细胞亚群分析发现HPC中GMP所占比例显著增加(正常对照为46.95±2.298%,化疗后第2、3、5、7及12天分别为61.80±3.245%、67.18±1.943%、76.5±3.46%、76.75±1.629%、64±2.843%,各时间点与正常对照进行统计学分析P值均为0)；而在疾病复发末期,骨髓造血细胞中长周期造血干细胞的比例较单纯白血病组降低[0.024±0.003%(单纯白血病组)vs 0.010±0.001%(白血病化疗组-d12)；P=0.008]。MRD阳性CR至复发模型中,同样证实造血干/祖细胞化疗后频数的增加早于白血病细胞,同时造血祖细胞在化疗后存在GMP分化偏移。(六)细胞周期的变化影响化疗后造血干/祖细胞及白血病细胞的频数变化,细胞凋亡并不参与造血恢复期及其后前者的改变MRD阴性CR至复发模型中,检测正常对照、化疗当天及化疗后小鼠骨髓CD45.2+LKS-及CD45.2+LKS+细胞的细胞周期状况,结果发现CD45.2+LKS细胞在整个过程中均较正常对照更多的处于G2-S-M期；而CD45.2+LKS+细胞变化则更加复杂：化疗后第1天处于G2-S-M期的该细胞比例即出现上升趋势[6.11±0.63%(d0)vs 9.48±1.06%(d1)],第5天白血病复发时再次进入静息状态[5.79±0.86%(d5)]然而在化疗后第12天白血病复发终末G2-S-M期比例再次增加[16.70±2.69%(d12)],与正常对照相比未见明显差异(p值为0.560)；白血病细胞在化疗后第一天大部分处于G2-S-M期[63.54±2.16%(d1)],G1期比例显著减少,之后其细胞数目显著减少、低于检测下限,化疗后第5天白血病细胞再次出现,此时处于G2-S-M期的细胞比例较低[16.48±3.14%(d5)],而于第7天恢复至近似未经化疗处理的白血病细胞的增殖状况[25.25±1.75%(d7)vs 22.18±1.20%(d0)]。在MRD阳性CR至复发组中,检测到类似的细胞周期改变。进一步检测MRD阴性CR至复发模型中造血干祖细胞在化疗后第0.4、1、2、5及12天的凋亡状况,结果发现：化疗后第0.4及1天化疗组小鼠造血干/祖细胞中凋亡细胞的比例明显增高[HSC：6.92±1.65%(正常对照),10.48±6.28%(d0.4)；14.19±1.72%(d1)；HPC：7.85±1.78%(正常对照),5.78±1.00%(d0.4)；17.70±1.39%(d1)],尤其以造血祖细胞表现更为显著,而自此以后的造血恢复期中白血病化疗组骨髓造血干/祖细胞的细胞凋亡水平与正常小鼠对照相比未见明显差异。大剂量一天化疗后的第3及第5天,流式细胞仪分选造血干细胞(CD45.2+LKS+),第1、5及12天分选白血病细胞进行细胞周期相关基因表达水平的检测,结果发现：相比正常小鼠骨髓造血干细胞,化疗后第3天小鼠骨髓造血干细胞中周期正性调控基因表达上调,第5天表达下降；与未经化疗处理的单纯白血病细胞相比,化疗后第1天小鼠骨髓白血病细胞中细胞周期正性调控基因表达上调为主,第5天正性调控基因表达下调为主,第12天这些基因的表达状况与未经化疗处理的单纯白血病对照组相比未见明显差异。以上结果说明化疗后骨髓造血干/祖细胞先于白血病细胞恢复增殖状态,细胞凋亡对于化疗后造血干/祖细胞造血恢复期及其后的变化未见明显影响。(七)白血病化疗后骨髓造血细胞的体内竞争性造血重建功能减弱伴有髓系分化受损白血病大剂量一天化疗组,分选化疗后第1、2、5及12天小鼠骨髓中的造血细胞,分别与相同数目的正常小鼠骨髓造血细胞行竞争性骨髓移植实验,从移植后第1个月开始每月检测待测试细胞移植贡献率及各系分化状况发现(以下列举移植后第4个月数据为例)：从化疗后第1天到第12天,白血病化疗小鼠骨髓造血细胞的移植贡献率呈逐渐下降趋势[70.32±8.71%(d1),79.93±3.02%(d2),50.13±7.64%(d5)和1.57±1.09%(d12)],同时逐渐出现髓系造血的抑制。(八)白血病化疗后造血干细胞衰老相关标记增加,同时造血干细胞功能相关基因的表达发生改变白血病小鼠大剂量一天化疗后第3及第5天分别检测骨髓造血干细胞(CD45.2+LKS+)中衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β gal)底物C12-FDG的表达状况,发现与正常对照(124.6±20.27)相比,其表达强度均明显增高：化疗后第3天539.7±126(P=0.0069),化疗后第5天296.6±51.94(P=0.0259)；进一步分选这两个时间点中化疗组及正常对照组小鼠骨髓造血干细胞(CD45.2+LKS+)进行衰老及造血干细胞功能相关基因表达水平的检测,发现化疗组小鼠骨髓造血干细胞中细胞衰老相关基因P16及P21的表达升高,而EGR1及FOS的表达降低。四、结论(一)成功利用非照射性小鼠急性T淋巴细胞白血病联合传统化疗药物建立化疗药物剂量&疗程依赖性的化疗模型,其中包含微小残留病阳性及阴性的完全缓解至复发急性白血病化疗模型；(二)利用动物模型,证实急性白血病小鼠化疗后体内正常造血干/祖细胞的增殖早于白血病细胞的复发,这一过程中出现造血祖细胞分化的GMP偏移与长周期造血干细胞比例的降低；(三)细胞周期参与急性白血病小鼠化疗后骨髓造血干/祖细胞的变化,而细胞凋亡与造血恢复期及其后造血干/祖细胞的改变无关；(四)急性白血病化疗后复发小鼠体内造血干细胞的正常造血重建功能受损,而这种损伤可能是因过度增殖诱发的细胞衰老所致。