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乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染导致乙型肝炎的发生,严重威胁着人类的生命健康。目前的治疗药物存在毒副作用大、价格昂贵、不能完全清除病毒且易产生耐药性等诸多问题。因此,寻找新型的抗HBV药物,成为当前研究的热点。目前认为,HBV共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA,cccDNA)是乙肝病毒复制的第一中间体,是HBV存在和持续复制的根本原因。因此,开展对HBV cccDNA的定量检测,对于判断HBV在肝细胞内复制的状况具有重要的意义,使之能够更准确的评价抗HBV药物的疗效。本文首先建立了一种HBV cccDNA SYBR Green I荧光定量PCR检测方法;然后应用HepG2.2.15细胞株,采用MTT、ELISA和荧光定量PCR检测方法,对60种新型核苷类化合物进行初步体外筛选,力求获得低毒、高效的抗HBV候选药物。第一部分;HBV cccDNA荧光定量检测方法的建立。[目的]建立一种稳定、特异、敏感的HBV cccDNA SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。[方法]根据HBV松弛环状DNA(relax drcular DNA,rcDNA]与cccDNA的结构差异,设计跨越双缺口的特殊引物,并利用一种ATP依赖不降解质粒的DNA酶(Plasmid-SafeTM ATPdependent Dnase,PSAD)提高反应的特异性;建立荧光定量PCR标准曲线,并进行特异性、敏感性和重复性检验。应用所建立的方法评价拉米夫定和阿德福韦酯对HBV cccDNA的抑制效果。[结果]该方法能特异性检测到HBV cccDNA,在2.68×108～2.68×103copies/μl检测范围之间有良好的线性关系,相关系数为-1.00,扩增效率为102％;最低检测限为2.68×101copies/μl。拉米夫定和阿德福韦酯对HBV cccDNA均有很好的抑制效果。[结论]该实验所建立的方法稳定性强、特异性好、灵敏度高,可快速定量检测HBV cccDNA,用于抗HBV药物的评价。
第二部分:抗HBV化合物体外筛选研究。[目的]从60种新型核苷类化合物中筛选出具有体外抗HBV活性的新型化合物。[方法]选用拉米夫定(3TC)作为阳性药物,通过MTT法检测受试样品对HepG2.2.15细胞的毒性,ELISA法检测样品作用后第3、6、9天细胞上清液中HBsAg和HBeAg的变化,以细胞的半数毒性浓度(CC50)、半数抑制浓度(IC50)、治疗指数TI(CC50/IC50)为指标,对60个受试样品进行初筛,筛选出具有体外抗HBV活性的样品,然后应用实时荧光定量PCR法检测活性样品对HBV DNA和HBV cccDNA含量的影响,从而对样品的抗HBV活性做出进一步的评价。[结果](1)对60个受试样品进行初筛,共筛出13个样品的CC50值大于3TC(858.71μM)。(2)针对毒性较低的13个受试样品,根据毒性测定结果设定合适的筛选浓度,结果显示核苷类化合物GL110030、GL110054对HBsAg和HBeAg的分泌具有较强的抑制作用,用药9天的治疗指数均远大于10.0。(3)核苷类化合物GL110030、GL110054在1μM、0.1μM、0.01μM时,显著影响HepG2.2.15细胞上清中的HBV DNA含量,平均抑制率分别为76.06%、62.15%、54.87%及77.01%、68.68%、53.56%;同时,对HepG2.2.15细胞内的HBV DNA含量也均产生显著影响,其平均抑制率分别为61.92%、51.80%、36.48%和68.00%、60.47%、38.14%。(4)GL110030、GL110054对HcpG2.2.15细胞内cccDNA拷贝数有明显影响,在1μM、0.1μM、0.01μM时,细胞内HBV cccDNA含量分别为0.59±0.2×103、3.02±0.43×103、6.06±1.46×103copies/μl及0.56±0.11×103、2.34±0.97×103、5.21±0.87×103copies/μl;与正常对照组13.78±0.78×103 copies/μl相比,其含量有明显的下降,差异具有统计学意义(P＜0.01)。[结论]对60个受试样品进行初筛,得出对HepG2.2.15细胞具有较低毒性的样品共13个,其中GL110030、GL110054能显著抑制乙肝病毒抗原、HBV DNA及HBV cccDNA,在体外具有低毒高效的抗HBV作用,有望成为抗HBV的候选药物。
第三部分:结论。概括叙述了本课题的主要研究成果及意义。
第四部分:文献综述。概括介绍了核苷类抗乙肝病毒药物研究进展和HBVcccDNA研究进展。其中包括乙型肝炎的发病机制、药物作用机制、主要的抗HBV核苷类药物以及HBVcccDNA检测的方法及意义等。