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目的建立大鼠骨癌痛(bone cancer pain,骨癌痛)模型,检测骨癌痛大鼠脊髓M-CSF的表达,并初步探讨M-CSF对骨癌痛痛觉敏化影响的作用机制,以期为骨癌痛的治疗方法提供新的理论依据。方法1.制备胫骨注射用Walker256乳腺癌细胞取Walker256乳腺癌细胞(上海素冉生物科技有限公司)腹腔注射入150~180g的健康成年雄性SD大鼠。每日观察大鼠腹部种植乳腺癌细胞的变化,5~7天后形成腹水并抽取。用PBS溶液漂洗并离心(转数800r/min)抽取的腹水3次,每次离心5min。制备好的癌细胞置于冰块上。2.实验动物重约170~210g的健康成年雄性SD大鼠(济南鹏越有限责任公司),于24±0.5℃室温下,昼夜各12小时自由饮食喂养。3.鞘內置管与之前的研究报道相同,在大鼠注入麻醉剂后,将PE-10导管置于蛛网膜下腔腰膨大位置。4.骨癌痛大鼠模型的制备参考既往骨癌痛模型的相关研究,取鞘內置管成功的大鼠并将Walker256乳腺癌细胞(10ul 5X10~6细胞/毫升)注入大鼠右侧胫骨上端骨髓腔里制备骨癌痛模型。5.行为学测试大鼠置于带有金属丝网格的透明玻璃笼子里,在测验之前静置于笼子中30min。用Von Frey细针测试待测大鼠的缩足反应阈值(PWT)。测试持续时间为5s,PWT重复测量3次,间隔时间为10min。6.免疫蛋白印记用蛋白免疫印迹的方法(免疫蛋白印记)检测假手术组大鼠和骨癌痛组大鼠M-CSF蛋白和嘌呤2X4受体(P2X4R)的表达。7.免疫荧光双标用免疫荧光双标法检测手术组大鼠和骨癌痛组大鼠脊髓背部小胶质细胞激活标志物Iba1与P2X4R的共表达8.动物实验分组建立骨癌痛模型:取重约170~210g置管成功的大鼠24只,随机分为3组:对照组(Naive组)、假手术组(sham组)、骨癌痛组(BCP组)。测定建模后3组第0、1、2、4、8、14天大鼠缩足反应阈值(PWT)。M-CSF、P2X4R与Iba1在脊髓的表达:清洁雄性SD大鼠16只,重约170~210g,随机分为2组:假手术组和骨癌痛组,用免疫蛋白印记法测定骨癌痛组大鼠第0、4、8、14天时大鼠脊髓M-CSF蛋白的表达水平。用免疫荧光双标法测定Iba1与P2X4R在脊髓背部的共表达。M-CSF受体阻断剂(GW2580)对大鼠骨癌痛的影响在建模成功第14天时取32只健康雄性SD大鼠,随机分为4组:Sham组,Sham+GW2580组、BCP组,BCP+GW2580组。鞘內注射GW2580溶液100uM 20ul。分别在给药前、给药后15min、30min、60min、90min和120min时测定大鼠PWT的变化。免疫蛋白印记法检测4组大鼠给药后120min时Iba1与P2X4R的表达。8.试验所用药物及其给药途径GW2580购自MedChemExpress公司。注射途径为鞘内注射,通过PE-10管注射进入大鼠蛛网膜下腔,给药体积为20ul。结果1.对照组与假手术组在0、1、2、4、8、14天时PWT值无统计学差异(P>0.05)。骨癌痛组在第0天、1天、2天时PWT值的差异无统计学意义(P>0.05);而在第4天、8天、14天时PWT值的差异有统计学意义(P<0.05)。其中第14天时PWT的值最低,说明成功建立了骨癌痛模型。2.用免疫蛋白印记检测假手术组和骨癌痛组中大鼠脊髓M-CSF蛋白的表达水平。与假手术组相比,骨癌痛组大鼠在建模后4、7、14天脊髓M-CSF表达量增加呈时间依赖性并且其差异具有统计学意义(P<0.05)。第14天时M-CSF蛋白表达量最多,与骨癌痛大鼠PWT值的变化相一致。3.相比于假手术组,骨癌痛组大鼠在给药前以及给药后15min、30min、60min、90min和120min的PWT值明显下降(P<0.05)。与骨癌痛组相比,骨癌痛+GW2580组大鼠给药前、给药后15min、30min、60min、90min和120min的PWT值明显上升(P<0.05)。说明鞘內注射GW2580能够明显减轻骨癌痛。4.与假手术组、假手术+GW2580组相比,骨癌痛组大鼠在给药后120min脊髓中Iba1和P2X4R表达均明显上升(P<0.05)。与骨癌痛组相比,骨癌痛+GW2580组大鼠给药前、给药后120min的Iba1和P2X4R表达差异有统计学意义(P<0.05)。进一步解释GW2580是通过减少小胶质细胞的激活和降低P2X4R的表达起到镇痛作用。5.免疫荧光双标法显示,与假手术组相比,骨癌痛组大鼠在建模后第14天Iba1与P2X4R在脊髓背角表达均增加(P<0.05)并且共表达于脊髓背角的小胶质细胞上。而相比于骨癌痛组,骨癌痛+GW2580组大鼠在建模后第14天Iba1与P2X4R在脊髓背角的表达均明显减少(P<0.05)。结论在骨癌痛大鼠脊髓中P2X4R与Iba1在小胶质细胞上共表达并且M-CSF表达明显增加,阻断M-CSF受体是通过减少小胶质细胞的激活和降低P2X4R的表达起到镇痛作用。